1、第一部分TGF-β1誘導膽囊癌EMT發(fā)生中差異表達基因分析
　　 目的：
　　 為研究膽囊癌侵襲轉移的可能機制，我們利用TGF-β1誘導膽囊癌GBC-SD細胞發(fā)生上皮-間質轉化(EMT)，然后應用基因芯片技術檢測GBC-SD細胞與發(fā)生EMT的GBC-SD細胞的基因，分析其差異表達的基因。
　　 方法：
　　 使用5 ng/ml的TGF-β1誘導膽囊癌GBC-SD細胞株，分別提取該組和未經誘導的膽囊癌GBC

2、-SD細胞株組的總RNA，純化后再進行熒光標記、對寡核苷酸芯片進行雜交，激光掃描儀對其進行掃描，根據(jù)熒光強度來篩選出兩者之間的差異基因，然后進行在線生物信息學分析。
　　 結果：
　　 基因芯片實驗共篩選出264個在膽囊癌GBC-SD細胞和經TGF-β1誘導后膽囊癌GBC-SD細胞間表達差異的基因。166個基因在經TGF-β1誘導后膽囊癌GBC-SD細胞組中表達上調，98個基因表達下調，經基因功能分類注釋系統(tǒng)查詢(GO分

3、類)，他們涉及到細胞粘附、細胞周期等;信號通路分析發(fā)現(xiàn)他們涉及到細胞周期蛋白調節(jié)、磷酸肌醇介導的信號通路等。
　　 結論：
　　 我們利用基因芯片技術檢測膽囊癌GBC-SD細胞及TGF-β1誘導發(fā)生EMT后的膽囊癌GBC-SD細胞差異表達的基因。結合文獻檢索分析我們認為NT5E和FcGBP可能涉及到膽囊癌的侵襲轉移過程，因此將這兩個基因作為下一步深入研究的目標。
　　 第二部分NT5E和FcGBP基因及其蛋白在膽

4、囊癌組織中的表達及意義
　　 目的：
　　 通過檢測膽囊腺癌及慢性膽囊炎組織中NT5E和FcGBP的mRNA和蛋白質的表達，驗證第一部分基因芯片的結果，并探討這兩個蛋白與膽囊癌侵襲轉移的關系。
　　 方法：
　　 隨機收取了15例未行放化療患者的膽囊腺癌標本和15例慢性結石性膽囊炎患者的慢性膽囊炎標本，獲取其總RNA和總蛋白。NT5E和FcGBP的mRNA表達水平采用定量RT-PCR檢測;NT5E和FcG

5、BP的蛋白質表達水平采用Western-blot檢測。
　　 結果：
　　 1.通過定量RT-PCR分析顯示，膽囊腺癌NT5E mRNA的表達明顯上調，與慢性膽囊炎比較有高度顯著差異（1.012±0.019 vs0.225±0.021，P＜0.01）;而FcGBP mRNA在膽囊腺癌中的表達則與此相反，為明顯下調且有高度顯著差異(0.078±0.020 vs0.321±0.017，P＜0.01)。
　　 2.通過

6、Western-blot分析發(fā)現(xiàn)NT5E蛋白在膽囊腺癌中的表達有明顯上調，與慢性膽囊炎比較有高度顯著差異（0.826±0.011 vs0.412±0.017，P＜0.01）;而FcGBP蛋白在膽囊腺癌中的表達有明顯下調，與慢性膽囊炎比較有高度顯著差異(0.084±0.017 vs0.187±0.025， P＜0.01)。
　　 結論：
　　 膽囊腺癌中的NT5E mRNA以及其蛋白較慢性膽囊炎中的明顯高表達，而FcGBP

7、 mRNA則相反，為低表達，這正與前述基因芯片結果相符合:NT5E、FcGBP基因可能從兩個相反的方面涉及膽囊癌EMT調節(jié)，進而與膽囊癌侵襲轉移相關。
　　 第三部分膽囊良惡性病變組織中NT5E和FcGBP的表達及其臨床病理意義
　　 目的：
　　 檢測膽囊腺癌及其癌旁組織、腺瘤、息肉和慢性膽囊炎標本中NT5E和FcGBP的表達，探討其在膽囊良惡性病變中的臨床病理意義以及與膽囊腺癌侵襲轉移的關系。
　　

8、方法：
　　 共收集到了108例膽囊腺癌、46例癌旁組織、30例腺瘤、15例息肉和35例慢性膽囊炎組織標本切片，采用EnVision免疫組化二步法對NT5E和FcGBP進行染色，整理數(shù)據(jù)后利用SPSS軟件分析。
　　 結果：
　　 (1)108例膽囊腺癌中NT5E陽性表達為59例(54.6％)，46例癌旁組織中14例陽性(30.4％)，30例腺瘤中5例陽性(16.7％)，15例息肉中2例陽性(13.3％)，35例

9、慢性膽囊炎膽囊上皮中4例陽性(11.4％):膽囊腺癌中NT5E表達陽性率顯著高于癌旁組織、腺瘤、息肉和慢性膽囊炎膽囊上皮，差異均有高度顯著性(P＜0.01);另一方面108例膽囊腺癌中FcGBP陽性表達為52例(48.1％)，46例癌旁組織中中陽性為35例(76.1％)，30例腺瘤中陽性為24例(80.0％)，15例息肉中陽性為13例(86.7％)，35例慢性膽囊炎膽囊上皮中陽性為30例(85.7％)，F(xiàn)cGBP在膽囊腺癌中的陽性表達率

10、明顯低于其在癌旁組織、腺瘤、息肉和慢性膽囊炎膽囊上皮中的陽性表達率，并有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。此外，良性病變的膽囊上皮不論NT5E陽性表達、FcGBP陰性表達，光鏡下均可見呈不同程度不典型增生。
　　 (2) NT5E在高分化的腺癌、最大直徑＜2cm的腫塊以及無淋巴結轉移、無周圍組織侵犯的病例中，其陽性表達率明顯低于其在低分化的腺癌、最大直徑≥2cm腫塊以及發(fā)現(xiàn)淋巴結轉移和周圍組織浸潤的病例的陽性表達率(P＜

11、0.05或P＜0.01);但FcGBP在上述組織中的表達陽性率結果與NT5E相反(P＜0.05或P＜0.01);
　　 (3)采用Kaplan-Meier單因素生存分析，發(fā)現(xiàn)膽囊癌患者術后的平均生存期與其病理類型、有無淋巴結轉移、腫塊最大直徑、周圍組織侵犯的狀況等均有密切關系(P＜0.05或P＜0.01);NT5E表達陽性的患者術后生存期明顯低于陰性表達的患者（P＜0.05），而FcGBP陽性表達的患者則生存期明顯長于其陰性表達

12、的患者(P＜0.05)。NT5E陽性表達、FcGBP陰性表達患者的生存時間顯著少于NT5E陰性表達、FcGBP陽性表達患者(P＜0.01); Cox回歸多因素分析也表明NT5E表達陽性(P=0.019)或FcGBP表達陰性(P=0.004)均是膽囊腺癌預后不良的評價指標。
　　 結論：
　　 NT5E及FcGBP表達水平均為反映膽囊癌發(fā)生、進展以及臨床生物學行為的重要指標;NT5E陽性表達者和（或）FcGBP陰性表達者預