1、以轉(zhuǎn)CpTI基因蘋果(MalusdomesticaBorkh)組培苗(包括紅富士、喬納金、王林和皇家嘎拉等60個(gè)株系)為試材，對蘋果組培苗中的外源CpTI基因進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測技術(shù)研究。采用的技術(shù)流程為：通過提取蘋果組培苗中總RNA獲得CpTI的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得CpTI的特征片段。本研究對RNA提取方法進(jìn)行了研究，比較了目前常用的幾種提取植物組織中總RNA的方法，建立了RT-PC

2、R檢測技術(shù)體系。主要研究結(jié)果如下： 1.酚類化合物、多糖、蛋白質(zhì)和次級代謝產(chǎn)物是影響從蘋果組織中提取總RNA的幾個(gè)主要干擾因素。試驗(yàn)比較和改進(jìn)了RNAplant試劑盒法、CTAB-異硫氰酸胍法、改良CTAB法、尿素法和熱硼酸法等五種常用的植物組織總RNA提取方法。通過對RNA的質(zhì)量、提取效率、提取時(shí)間以及試劑費(fèi)用等多方面進(jìn)行比較，提出改良CTAB法為從蘋果組培苗中提取總RNA的最佳方法。該方法的提取緩沖液包括2﹪CTAB，2.0

3、mol/LNaCl，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，20mmol/LEDTA(pH8.0)，2﹪β-巰基乙醇(使用前加入)。該方法有效地去除了酚類化合物、多糖、蛋白質(zhì)等污染，在3小時(shí)之內(nèi)可得到高純度、完整的、適宜進(jìn)行RT-PCR操作的RNA模板，從而保證了檢測的成功。 2.利用DNaseI去除RNA中的DNA后，采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，建立了適合蘋果組培苗的反轉(zhuǎn)錄體系，合成的cDNA片段在100～1500bp之

4、間，可滿足對cDNA分析的要求。 3.依據(jù)CpTI基因序列設(shè)計(jì)合成特異引物，采用RT-PCR的方法擴(kuò)增出了309bp的PCR產(chǎn)物，與預(yù)期目的片段長度一致。 4.適合蘋果組培苗RT-PCR分析體系為：在反轉(zhuǎn)錄體系中，引物使用濃度為0.8μmol/L，RNA模板的用量為1.0μg；PCR選用25μL體系，引物濃度為0.6μmol/L，Mg2+濃度為1.6mmol/L，dNTPs濃度為300μmol/L，Taq酶用量為1.5U