1、腦膠質瘤作為人類最常見的原發(fā)性顱內腫瘤,有很高的發(fā)病率和死亡率。約占成人顱內原發(fā)腫瘤的30％-50％,近年來發(fā)病率還有增加的趨勢。惡性腫瘤的常規(guī)治療手段,如手術、放療、化療、生物治療等對膠質瘤的治療,效果甚微,膠質瘤患者的平均生存期仍較短。迄今的治療方法都不能從根本上治療這一致命的腫瘤。因而新療法的探索成為熱點課題。基因治療作為治療疾病的一種新手段,正愈來愈受到人們的重視和關注。常用的基因治療的方法包括基因置換和增補缺陷基因。將抑癌基因

2、轉移腫瘤細胞是直接殺傷或抑制腫瘤細胞的最有效的基因治療的措施之一。
　　 PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome10)抑癌基因,即第10號染色體缺失的與張力蛋白同源的基因,是新近發(fā)現(xiàn)的一個具有雙特異性的抑癌基因,在膠質瘤干細胞的表達譜中缺失。PTEN基因位于10號染色體q23.3,有9個外顯子和8個內含子。第5個外顯子編碼第122和123位氨基酸,該

3、編碼序列與蛋白質絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶和蛋白質酪氨酸磷酸酶催化中心具有同源序列,表明該區(qū)域具有雙特異性磷酸酶功能。PTEN蛋白所具有的雙特異性磷酸酯酶的活性在抑制腫瘤中具有極其重要的作用,除了能使磷酸絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸去磷酸化,發(fā)揮蛋白磷酸酯酶的作用外,還能通過抑制1-磷酸酰肌醇-3-激酶(PI3K)的產(chǎn)物磷酸酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)的磷酸化,發(fā)揮脂性磷酸脂酶的功能,在PI3K信號傳導通路中起負性調節(jié)作用。PTEN直接使P

4、IP3的D3位去磷酸化,這是PTEN抑制細胞生長和促進凋亡的重要機制。PTEN蛋白的表達能抑制PI3K激酶信號通路介導的下游事件,如:PKB/Akt細胞存活增殖信號的激活,促進G1細胞周期轉換P70S6-激酶的激活。PTEN基因已經(jīng)成為有市場前景的抑癌基因。
　　 為進一步探討PTEN基因及蛋白在腦膠質瘤中的作用,我們通過臨床研究和基礎研究兩方面深入分析了PTEN在腦膠質瘤中的作用機制。通過研究我們檢測了PTEN基因水平以及蛋白

5、水平在腦膠質瘤中的表達以及與細胞凋亡的關系。通過基礎研究我們將外源性野生型PTEN轉染膠質瘤細胞系,觀察野生型PTEN在體外及體內對膠質瘤細胞的治療作用,并檢測其可能的作用機制,為腦膠質瘤的基因治療提供理論依據(jù)。系統(tǒng)的研究PTEN-PI3K-Akt-NF-κB以及下游靶基因的信號傳導通路,在國內外尚無報道。
　　 第一部分 PTEN在正常腦組織及腦膠質瘤中的表達與細胞凋亡關系的研究
　　 目的:探討PTEN(phosph

6、atase and tensin homology deleted onchromosome ten)在人腦膠質瘤及正常腦組織中的表達以及與細胞凋亡的關系。
　　 方法:應用免疫組織化學SP及Western blot檢測人正常腦組織及人腦膠質瘤組織中PTEN蛋白水平的表達,半定量RT-PCR法檢測人正常腦組織和人腦膠質瘤中PTEN mRNA水平的表達,以及TUNEL法檢測人正常腦組織和人腦膠質瘤中細胞凋亡的情況。
　　

7、結果:
　　 1 PTEN在正常人腦組織標本中過度表達,在膠質瘤組織標本之中有表達,且隨著級別的增加表達的陽性率降低(Fig1),它們從正常到高級別的陽性率分別為100％、85.7％、63.6％、50％(table.1),低級別膠質瘤(Ⅰ-Ⅱ)和高級別膠質瘤(Ⅲ、Ⅳ)之間具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2 PTEN在蛋白水平均為正常腦組織表達高于人腦膠質瘤,隨著膠質瘤級別的升高,PTEN蛋白表達水平明顯降低(Fi

8、g2),其相對表達量分別為0.667±0.203、0.475±0.169、0.237±0.087、0.153±0.046(table2),膠質瘤各級別之間表達有顯著差異(P＜0.05)。
　　 3 PTEN在mRNA水平均為正常腦組織表達高于人腦膠質瘤,隨著膠質瘤級別的升高,PTENmRNA表達水平明顯降低(Fig2),其相對表達量分別為3.767±0.865、2.530±0.619、1.853±0.436、0.688±0.14

9、0(table2),膠質瘤各級別之間表達有顯著差異(P＜0.05)。
　　 4 人正常腦組織中細胞凋亡率明顯低于人腦膠質瘤,兩組之間表達有顯著差異(P＜0.05)(Fig4),且隨著級別的增加表達的細胞凋亡率降低,它們從正常到高級別的凋亡率分別為3.2±0.5％、46.4±6.7％、37.2±5.2％、21.2±5.1％(table.4),細胞凋亡率與膠質瘤級別的升高以及PTEN mRNA及蛋白表達水平密切相關(P＜0.05),

10、隨著PTEN mRNA及蛋白表達水平表達升高,細胞凋亡率隨之下降。
　　 結論:PTEN mRNA及蛋白表達水平在人腦膠質瘤中隨級別的升高表達下降,PTEN與細胞凋亡密切相關,可能成為其診療的一個新的指示靶點。
　　 第二部分 PTEN基因重組腺病毒對膠質瘤細胞株增殖、凋亡以及細胞周期的影響
　　 目的:探討抑癌基因PTEN對人膠質瘤U251、U87、A172細胞系增殖、凋亡及細胞周期的影響,并對其可能的作用機制

11、進行探討。
　　 方法:將攜帶PTEN及綠色熒光蛋白的重組腺病毒(Ad-PTEN-GFP)或空載體腺病毒(Ad-GFP)轉染人膠質瘤U251、U87、A172細胞系。MTT檢測細胞生長曲線;TUNEL法檢測細胞凋亡;流式細胞儀檢測Ad-PTEN-GFP轉染后細胞周期分布以及細胞凋亡率;半定量PCR(RT-PCR)檢測PTEN、CIAP1、CIAP2、XIAP、Survivin mRNA水平變化;Western Blot檢測PTE

12、N、AKT、p-AKT,IκB,P65、CIAP1,CIAP2、XIAP,Survivin、CyclinD1,P27、Bcl-2、Bax蛋白水平變化。
　　 結果:
　　 1 攜帶PTEN腺病毒轉染的檢測結果
　　 Ad-PTEN感染膠質瘤細胞后,細胞在第三天達到最高轉染率,當感染復數(shù)(M.O.I)為100時,熒光顯微鏡鏡下顯示細胞的熒光表達率均為80％以上(Figl、2、3),符合基因治療對載體的要求。

13、　　 2 MTT檢測細胞生長曲線
　　 在MOI=100時,Ad-PTEN-GFP轉染組與Ad-GFP轉染組各時間段細胞吸光度相比,增殖活性程度均降低(P＜0.01 Fig7),差異具有統(tǒng)計學意義。PTEN增高后明顯降低膠質瘤細胞株的增殖活性。
　　 3 TUNEL法檢測細胞凋亡
　　 在MOI=100時,腺病毒轉染U251、U87、A172細胞系后,分別取1d、3d、5d后轉染Ad-PTEN-GFP組細胞凋亡

14、比例均明顯高于未轉染組,且于第5天,細胞凋亡比率最高(Fig6、9 P＜0.01)。
　　 4 流式細胞儀檢測細胞凋亡以及細胞周期變化
　　 Ad-PTEN-GFP轉染U251、U87、A172細胞后與Ad-GFP組相比細胞凋亡率逐漸增加,空白對照和無義序列組相比凋亡率明顯增加,提示PTEN基因表達上調明顯誘導膠質瘤細胞株的凋亡(Fig10)。細胞周期分析顯示,當Ad-PTEN-GFP轉染U251、U87、A172細胞后

15、5天,G1期細胞比例增加,S期細胞比例降低,細胞周期阻滯于G1期(Fig8);
　　 5 RT-PCR檢測PTEN以及IAP家族mRNA水平
　　 以M.O.I=100轉染U251、U87、A172細胞系1、3、5天,Ad-PTEN-GFP組與Ad-GFP組的CIAPl、CIAP2、XIAP、Survivin mRNA表達水平相比表達明顯降低,且于第3天IAP家族mRNA表達水平降至最低水平。IAP家族mRNA表達水平與

16、PTEN mRNA表達水平呈負相關改變(Fig4、5;table3、4 P＜0.01)。
　　 6 Western blot檢測PTEN及相關靶基因的蛋白水平
　　 以M.O.I=100轉染U251、U87、A172細胞系1、3、5天,Ad-PTEN-GFP組與Ad-GFP組的AKT、p-Akt、IκB、P65、Iaps、CyclinD1、P27、Bcl-2家族蛋白表達水平相比明顯變化,且其蛋白表達水平與PTEN蛋白表達

17、水平密切相關(Fig5,table4)。
　　 結論:高表達PTEN能夠明顯抑制人膠質瘤U251、U87、A172細胞系增殖并誘導凋亡,其可能與PTEN-PI3K/AKT-NF-κB信號通路被激活有關,并通過此通路調控多種凋亡相關因子家族,如IAPs及Bcl-2家族,并通過調控細胞周期相關因子導致細胞周期阻滯。
　　 第三部分 PTEN基因重組腺病毒抑制裸鼠膠質瘤生長的實驗研究
　　 目的:探討Ad-PTEN對人

18、膠質瘤荷瘤裸鼠的治療作用,并對其可能的作用機制進行探討。
　　 方法:建立裸鼠膠質瘤模型;將攜帶Ad-PTEN-GFP或空Ad-GFP注射治療腫瘤,觀察腫瘤生長情況及裸鼠生存期,TUNEL法檢測細胞凋亡;免疫組化檢查PTEN及P65蛋白水平變化。
　　 結果:
　　 1 各組腫瘤生長情況及裸鼠存活時間
　　 U251細胞以7×105接種裸鼠后20天左右均可見腫瘤結節(jié)形成,瘤體內注射5次,Ad-PTEN組腫

19、瘤體積生長明顯變慢,較對照組體積小,治療6周后腫瘤體積抑制率82.50％,與對照組相比有顯著性差異(p＜0.05 Fig5)。U251和Ad-GFP治療組裸鼠腫瘤生長迅速,生存狀態(tài)較差,均在移植后28～80天內相繼死亡,兩組裸鼠的平均生存時間分別54±7天和58±8天,Ad-PTEN治療組裸鼠的生存狀態(tài)明顯好于另外兩組,腫瘤生長緩慢直至移植后120天觀察結束仍有2只裸鼠存活,平均生存時間103±10天,生成時間顯著延長(Fig6)。

20、r>　　 2 各組中目的蛋白及凋亡的表達
　　 免疫組化顯示PTEN及P65蛋白主要表達于細胞核,偶有胞漿表達,著色后成棕黃色、棕褐色顆粒。其Ad-PTEN治療組中PTEN表達明顯增高,P65表達明顯降低,細胞凋亡增加(Figl-3),其表達差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論:各組細胞接種裸鼠后均可見移植瘤的生長,Ad-PTEN治療后能明顯抑制腫瘤在裸鼠內的生長,延長裸鼠的生存期,免疫組化結果提示PTEN可能通過PTEN-