1、目的: 超短波治療具有消除炎癥、減少水腫、促進血管舒張、改善血液循環(huán)、營養(yǎng)組織器官和增強組織代謝的功效，超短波對損傷組織的修復作用在康復學領域已得到證明并已被廣泛應用。有研究證明，通過脫細胞支架和超短波治療結(jié)合的方法，在修復大鼠坐骨神經(jīng)損傷的治療中起到了加速神經(jīng)生長速度的作用。近年來隨著組織工程學的不斷發(fā)展，應用帶有種子細胞的支架材料修復周圍神經(jīng)損傷已經(jīng)日趨成熟。同種異體脫細胞神經(jīng)細胞外基質(zhì)材料(acellular extrac

2、ellular matrix，AECM)作為有生物活性的神經(jīng)替代物，具有良好的仿生性和組織相容性，移植后為軸突再生提供適宜的微環(huán)境，能夠有效促進神經(jīng)再生。近年來隨著對骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)分化為施萬細胞研究的日益深入，證明它具有可塑性高、免疫原性低、體外易于獲得能夠快速擴增和長期存活的特性，這些條件使之成為修復周圍神經(jīng)損傷理想的種子細胞。本實驗是觀察小劑量超短波對種植BMSC的

3、脫細胞支架修復大鼠坐骨神經(jīng)損傷的作用，為臨床神經(jīng)損傷修復和康復治療提供實驗依據(jù)。 材料與方法: 1、脫細胞神經(jīng)移植物的制備 Wistar大鼠，經(jīng)麻醉后取出兩側(cè)的坐骨神經(jīng)，采用化學萃取脫細胞方法制備脫細胞神經(jīng)基質(zhì)支架。 2、BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 取生后25～30天的雄性Wistar大鼠，從脛骨和股骨內(nèi)分離出BMSCs，采用貼壁法純化細胞并培養(yǎng)至第三代備用。 取第三代BMSCs分別在

4、成骨誘導培養(yǎng)液和成脂肪誘導培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，觀察其形態(tài)的改變。茜草素紅染色和油紅O染色分別鑒定BMSCs向成骨和成脂肪誘導的細胞。 3、實驗動物和分組 雄性Wistar大鼠48只，體重為200～250g，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供，實驗分為3組，即支架內(nèi)注射達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、支架內(nèi)注射BMSCs組和注射BMSCs后應用超短波治療組

5、，各組分別于移植后的第2、4、8和12周各處死4只。 4、脫細胞神經(jīng)支架移植 取第三代BMSCs，用微量注射器按照接種濃度為1×106個/毫升注入到制備好的支架內(nèi)并置于培養(yǎng)箱內(nèi)聯(lián)合培養(yǎng)3天；在無菌條件下縫合聯(lián)合培養(yǎng)的神經(jīng)支架到神經(jīng)缺損處。 5、超短波治療 術后第二天即采用小劑量超短波對移植動物的神經(jīng)缺損處治療。 6、觀察指標及檢測方法 (1)光鏡和電鏡觀察AECM的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 (2

6、)在倒置顯微鏡下觀察BMSCs的細胞生長情況。 (3)足跡實驗檢測大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic function index，SFI)，跟蹤觀察其神經(jīng)功能恢復情況。 (4)甲苯胺藍染色觀察再生神經(jīng)的纖維數(shù)目、軸突直徑，透射電鏡檢測再生神經(jīng)的髓鞘厚度。 (5)免疫熒光染色分析再生的神經(jīng)內(nèi)的S—100、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)和血管內(nèi)皮生長因

7、子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達。 (6) RT-PCR檢測再生的神經(jīng)內(nèi)S—100mRNA和VEGFmRNA表達。 7、統(tǒng)計學分析。 實驗結(jié)果: 1、光、電鏡觀察到采用化學萃取脫細胞方法制備的AECM完整地保留了以基底膜管為主構(gòu)成的三維立體結(jié)構(gòu)。 2、倒置顯微鏡下觀察到貼壁的BMSC細胞呈圓形，成纖維細胞樣或紡錘體樣，12天后能夠達到90％

8、融合。 3、用茜草素紅和油紅O分別對向成骨細胞和脂肪細胞誘導的BMSCs進行染色發(fā)現(xiàn)各自向誘導的細胞分化，即有紅色的骨基質(zhì)的沉積和脂滴形成。 4、實驗動物行走實驗證明隨著時間的增長SFI逐漸上升，超短波治療組SFI上升的更快。 5、再生神經(jīng)的甲苯胺藍染色和透射電鏡檢測顯示：隨著移植術后時間增長，超短波治療組治療組的再生神經(jīng)髓鞘的厚度增加、直徑增大和神經(jīng)纖維數(shù)目增多。 6、免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)S—100蛋白和G

9、FAP蛋白在再生的神經(jīng)內(nèi)都有陽性表達并且和時間成依賴性增長，在超短波治療組的表達優(yōu)于其它兩組。VEGF的表達在第4周達到頂峰然后逐漸下降。 7、RT-PCR檢測再生的神經(jīng)內(nèi)S—100mRNA表達與時間增長成正比，超短波治療組內(nèi)的S—100mRNA和VEGFmRNA表達明顯增多。VEGFmRNA在術后第4周表達最多。 結(jié)論: 1、注入BMSCs的脫細胞支架對神經(jīng)損傷恢復的作用要好于單純的脫細胞支架，應用超短波治療之