1、每個睪丸支持細胞(Sertoli細胞)與30～50個生殖細胞相聯(lián)系，Sertoli細胞與生精細胞共同構成睪丸的精曲小管，Sertoli細胞不僅在結構上為生精細胞的分化成熟提供支架，供給生精過程所需的能量及營養(yǎng)物質；同時可分泌如轉運蛋白類、調節(jié)蛋白類、生長因子類、類固醇類等數十種物質參與生精細胞的分化成熟，具有精細的協(xié)調作用，保證精子發(fā)生的正常有序進行。Sertoli細胞之間接近基底水平的緊密連接是血睪屏障主要結構成分，在精子發(fā)生過程中，

2、細線前期和細線期精母細胞必須不斷從曲細精管上皮的基底部穿越血睪屏障向腺腔部分遷移，并分化為單倍體精細胞，生殖細胞的遷移過程包含了細胞間緊密連接(TJs)和黏附連接(AJs)精細的動力學變化：時相性“關閉”和“開放”。如果能干擾Sertoli細胞間的連接，勢必使正常的精子排放受到影響。這可能成為男性避孕措施的有效途徑。 閉鎖因子是組成緊密連接的關鍵膜蛋白，該蛋白由4個跨膜結構域，2個胞外環(huán)，1個胞內環(huán)，1個小NH2-末端胞質結構域

3、，1個大的COOH-末端胞質結構域組成。其第1個胞外環(huán)發(fā)揮細胞黏附作用，其第2個胞外環(huán)可干擾上皮細胞株中緊密連接屏障的裝配。它的任何改變均可破壞TJs，從而破壞AJs，而TJs在精子的成熟和釋放中起著關鍵性的作用。細胞間的TJs廣泛存在于各類組織細胞中，如果非靶向地干擾閉鎖因子功能，可能導致機體其它組織細胞間TJs屏障的非特異性功能損害，出現(xiàn)嚴重副作用。為此，將對應閉鎖因子的多肽與靶向作用于Sertoli細胞的特異性分子耦合，通過特異性

4、靶向干擾睪丸內Sertoli細胞間TJs蛋白的功能狀態(tài)，才能特異性抑制或干擾精子發(fā)生和排放過程，達到可逆性避孕目的。卵泡刺激素(FSH)是女性卵泡成熟和男性精子發(fā)生必須的糖蛋白。在男性，F(xiàn)SH受體僅存在于Sertoli細胞胞膜上，F(xiàn)SH由α、β兩個亞單位組成，其中α-亞單位與LH、HCG等激素具有共同序列，而β-亞單位具有種屬和激素特異性。 本研究選擇僅有受體結合活性，但無激素生物活性的FSH-β亞單位中的部分序列，與編碼閉鎖因

5、子中第二個胞外環(huán)發(fā)揮緊密連接功能的相應基因序列進行基因重組，通過畢赤酵母真核表達獲得融合蛋白，以期獲得可靶向干擾Sertoli細胞功能，從而干擾精子生成達到避孕的目的。 本研究內容主要分三個部分：①pPIC9KFSH-Occludin酵母表達載體的構建。利用RT-PCR技術，從小鼠新鮮腦組織中提取總RNA擴增獲得FSH-β亞單位，同法從小鼠新鮮睪丸組織中提取總RNA擴增occludin。通過部分重疊：PCR擴增，獲得含F(xiàn)SH-β

6、亞單位特定基因序列和閉鎖因子第2個胞外環(huán)序列的耦合片段，NotI+EcoRI雙酶切pPIC9K質粒及目的片段后分別鋪膠回收，連接過夜。所構建載體均轉化大腸桿菌，快速抽提陽性質粒DNA，酶切及測序鑒定。②FSH-Occludin蛋白在畢赤酵母中表達、純化及活性初步鑒定。構建載體以電穿孔法轉染酵母菌GS115，依次進行G418篩選，PCR篩選鑒定、Mut篩選及小量搖瓶培養(yǎng)實驗，尋找高拷貝菌株與表達蛋白的最佳收獲時段，篩選結束后大量搖菌，于最

7、佳時段收獲上清液，經超濾濃縮、分子篩純化后將所收集樣品冷凍抽干備用。純化后蛋白用SDS-PAGE、Western-Blot鑒定，并用免疫組化法檢測其生理活性。③FSH-occludin融合蛋白避孕效應的研究。本研究將FSH-occludin融合蛋白皮下注射Balb/c小鼠，取各時期動物血清，應用酶聯(lián)免疫法檢測性激素睪酮和FSH的濃度并監(jiān)測血清抗體滴度的變化，并用光鏡和電鏡觀察了融合蛋白所導致睪丸組織的免疫性病理變化，動物免疫結束后合籠檢

8、測其免疫性避孕效應與可逆性。 研究的主要實驗方法及結果如下： 1.通過生物信息學分析設計合成引物，采用RT-PCR技術分別從小鼠腦組織和睪丸組織成功擴增出FSH和Occludin的cDNA序列，PCR擴增出FSH-β亞單位33-100aa(68aa)及Occludin207-228aa(22aa)和197aa-241aa(45aa)區(qū)域的3個目的片段，通過部分重疊雙重PCR法獲得閉鎖因子第二個胞外環(huán)序列和FSH-β亞單位

9、基因序列的耦合片段，酶切連接后構建了2種載體(Ppic9k-6822與Ppic9k-6845)，本研究將編碼FSH-β亞單位上36及39位氨基酸上的TGT(半胱氨酸)突變成TCT(絲氨酸)使其與受體的結合不受影響，但減少了其生物激動劑的活性。經測序證實完全符合預想設計。 2.將表達載體采用單交換的整合方式電轉化畢赤酵母菌株GS115，篩選高拷貝重組轉化子，經SDS-PAGE和Westernblot分析證實獲得了重組蛋白，完成了F

10、SH-Occludin融合蛋白的酵母表達、純化及免疫組化生物活性鑒定。 3.將融合蛋白免疫：Balb/c雄鼠，對照組注射PBS。免疫后實驗組出現(xiàn)特異性IgG抗體，血清中促卵泡生成激素激素(FSH)及睪酮(T)水平各組無明顯差異。實驗組小鼠睪丸曲細精管管腔內的精子數以及附睪尾部精子數相對PBS組明顯減少，電鏡下觀察到免疫組支持細胞與生精細胞的緊密連接被打開，失去依托關系，生精細胞之間有較大間隙。結果證實重組蛋白可靶向性干擾Sert

11、oli細胞的TJs，實驗組受孕率、產仔率明顯低于對照組且其避孕效應具有可逆性。重組蛋白具有良好的靶向性，90d后免疫組的受孕率及產仔數均有不同程度的恢復符合可逆性避孕的研究設想。 由此實驗結果可以得出Occludin的第2個胞外環(huán)確是可以干擾細胞之間的TJs，而且第2個胞外環(huán)中的外部區(qū)域在緊密連接中有著非常重要的作用。融合蛋白能靶向干擾Sertolicell的TJs從而干擾精子生成且其避孕效應具有可逆性。本研究的實施為開辟一種安