1、骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）是中胚層來源的具有多向分化潛能的干細胞，存在于不同種屬的動物體內(nèi)（如雞、鼠、兔、犬、人），主要分布在全身的結(jié)締組織及組織器官中，以骨髓組織中的含量最為豐富。在不同的誘導條件下，MSCs具有向成骨細胞、成肌細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞和基質(zhì)細胞等中胚層細胞分化的能力，同時還可分化為外胚層的神經(jīng)細胞和內(nèi)胚層的肝細胞。隨著組織細胞工程學和基因工程學的發(fā)展，利用MSCs的多向分化的潛能，將其運用于組織工程、細胞因子替代

2、治療、基因治療、細胞移植及器官移植等方面的研究已成為熱點。 然而，MSCs在體內(nèi)含量很少，骨髓中每10萬單核細胞中大約有1個MSCs，且隨著年齡的增長，MSCs數(shù)量逐漸減少。顯然，如此微量的MSCs根本難以滿足細胞工程的需要。因此，如何摸索一個適宜的體外純化、擴增的培養(yǎng)條件，對于進一步研究MSCs的生物學特性、誘導分化和細胞移植就顯得尤為重要。 體外調(diào)節(jié)MSCs增殖的方法有很多種，其中力學刺激是一種重要的途徑。近年來，力

3、學因素對細胞和組織生長發(fā)育的調(diào)節(jié)一直是生物力學十分重視的研究領域，國內(nèi)外學者已經(jīng)在這一領域作了大量的研究工作，積累了豐富的研究經(jīng)驗。拉伸是力學刺激中的一種有效方法，文獻顯示：最佳刺激條件的拉伸能促進細胞增殖。但目前利用力學拉伸加載作用調(diào)節(jié)MSCs增殖的研究尚未見詳細文獻報道，其機理更不清楚。本實驗擬研制拉伸加載裝置，選取大鼠作為實驗材料，進行MSCs的原代分離、培養(yǎng)、鑒定。然后在一定條件下對MSCs的進行拉伸刺激，研究分析拉伸刺激后MS

4、Cs的增殖情況，從中找到在設定范圍內(nèi)，該拉伸裝置刺激MSCs增殖的最佳條件，并為以后MSCs在力學拉伸刺激下的定向分化及進一步研究打下良好基礎。 本實驗的研究方法和主要研究內(nèi)容包括：首先，研制一套符合實驗要求的拉伸加載裝置，初步設定拉伸參數(shù)，進行相關預實驗檢測；同時，選取成年大鼠作為實驗動物，采用Percoll梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離提取MSCs，培養(yǎng)傳代，進行相關鑒定；然后使用拉伸加載裝置，在一定的條件下，對MSCs進行拉

5、伸刺激，采用MTT法分析增殖影響，分子生物學相關技術(shù)分析與增殖相關的c-fos基因的表達變化，從中研究不同的拉伸刺激條件對MSCs增殖的相應影響，并總結(jié)出在設定的參數(shù)范圍內(nèi)，本實驗研制的拉伸加載裝置刺激MSCs增殖的最佳拉伸條件。 本實驗的研究結(jié)果如下： 一、拉伸加載實驗裝置的研制： 根據(jù)圓形基底膜形變拉伸原理，研制了彈性膜周期加載裝置，運用數(shù)字電路進行控制，LED顯示，參數(shù)易于控制，線性可調(diào)。刺激頻率范圍0.1

6、-1Hz，刺激大小范圍2％-15％，刺激時間人工調(diào)節(jié)，能滿足實驗要求。 二、MSCs的原代分離和培養(yǎng) 通過Percoll離心法（Percoll密度為1.073g/mL）得到的單核細胞24小時后貼壁，細胞呈圓形，72小時后呈紡錘形、梭形、多角形，增殖迅速，原代培養(yǎng)約14-20天左右可達到80-90％融合。傳代細胞24小時內(nèi)完全貼壁，5-7天內(nèi)達到80-90％融合。傳代至6-8代。運用免疫組化方法檢測了大鼠MSCs的4種表面

7、抗原的表達情況。結(jié)果顯示：CD34（造血干細胞標記物）陰性；CD44陽性；CollagenⅠ陰性；Fibronectin陽性。細胞周期分析：G0/G1細胞占93.7％，說明大部分細胞處于非增殖狀態(tài)。成骨細胞誘導液誘導后，細胞表達成骨細胞的標志AKP，出現(xiàn)鈣化點，并隨著時間的延長而加深。證明所培養(yǎng)的細胞為大鼠MSCs。 三、拉伸對MSCs的增殖影響 在1Hz刺激頻率下，通過三種刺激時間（15分鐘、30分鐘、60分鐘），三種

8、刺激大?。?％、4％、8％）的拉伸，MTT結(jié)果顯示：在拉伸刺激下，MSCs有不同程度增殖；方差分析顯示刺激時間對MSCs的增殖影響大于刺激大小的影響；在設定范圍內(nèi)，最佳刺激條件是刺激大小為8％，刺激時間為60分鐘；分子生物學技術(shù)分析結(jié)果顯示c-fos基因表達增強。 通過分析，可以認為本實驗研制的拉伸加載裝置能初步滿足研究需要。而采用Percoll梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法可以比較簡單有效地獲得MSCs，通過免疫組化方法檢測表面抗原