1、研究背景:
　　誘導細胞死亡的DFF45樣效應因子b蛋白(cell death-inducing DFF45-like effector,Cideb)是20世紀末發(fā)現的CIDE家族的重要成員,盡管最初被認為與細胞凋亡相關,但后來的研究顯示出Cideb是一個重要的脂滴表面蛋白,其定位于內質網和脂滴。載脂蛋白B(apolipoprotein B,apoB)是一種重要的載脂蛋白分子,是乳糜微粒(chylomicron,CM)和VLDL的

2、關鍵分子。進一步的研究結果顯示Cideb能夠通過與apoB相互作用,促進極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)的脂化過程,進而影響中性脂肪的分泌,同時Cideb參與了肝臟的脂肪代謝過程。然而,很多研究報道了Cideb表達于腎臟,且水平較高,但是其在腎臟的具體作用尚不明確。我們推測Cideb可能參與了腎小管的脂肪重吸收過程,但其具體作用以及可能的機制尚需深入研究。
　　腎臟是一個機體物質

3、代謝過程中的重要器官,并且很多腎臟疾病會出現脂質代謝的異常。比如腎病綜合征、糖尿病腎病、尿毒癥及腎移植術后。其中,以腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)時的高脂血癥最為突出。膜性腎病時,腎小球通透性增加,從而加重了腎小管重吸收的負擔,因此可作為研究腎小管重吸收功能的重要模型。本課題以Cideb敲除小鼠模型,確定Cideb缺失對腎臟脂肪含量的影響;通過膜性腎病小鼠模型和人類膜性腎病標本,檢測Cideb表達水平在膜性腎病

4、中的變化;用過表達和沉默Cideb的細胞模型,確定Cideb對腎小管上皮細胞脂肪代謝過程的影響。本研究不僅有助于闡明Cideb在腎臟中的作用,同時對了解腎臟脂肪代謝過程也具有重要意義。
　　研究目的:
　　1)分析Cideb在腎臟中的表達水平以及分布規(guī)律,并確定Cideb敲除小鼠腎臟中脂肪含量的變化。2)檢測膜性腎病腎穿刺標本和膜性腎病小鼠腎小管上皮細胞中Cideb表達水平,確定Cideb表達水平與腎小管重吸收功能之間的關系

5、。3)運用過表達和沉默Cideb的腎小管上皮細胞,確定Cideb在腎小管上皮脂肪重吸收和分泌中的作用,探討Cideb對腎小管上皮脂肪代謝的影響。
　　研究方法:
　　1)運用免疫組化技術,確定Cideb在腎臟中的表達水平和細胞分布情況,以及與載脂蛋白apoB在腎小管中的表達情況;
　　2)通過OilRedO染色和甘油三酯(triglyceride,TG)定量分析研究Cideb敲除小鼠腎臟內脂肪的變化,確定Cideb缺失

6、腎小管上皮細胞脂肪含量的影響;
　　3)尾靜脈注射C-BSA建立膜性腎病的動物模型,通過血尿生化分析和各種組織學方法進行鑒定。運用免疫組化方法分析,腎病綜合征小鼠腎小管上皮中Cideb和apoB的表達水平,并通過OilRedO染色確定腎臟的脂肪含量變化;
　　4)收集膜性腎病高脂血癥患者的腎穿刺標本,通過免疫組化分析腎小管上皮Cideb、apoB的表達水平;
　　5)通過不同濃度的棕櫚酸刺激人類近端腎小管上皮細胞系HK

7、-2細胞,通過Westernblot、Bodipy493/503染色、TG定量分析等方法確定Cideb表達水平與腎小管上皮細胞內脂滴數量、脂肪含量的關系;
　　6)用攜帶Cideb和CidebsiRNA的腺病毒感染HK-2細胞,建立Cideb過表達和沉默的HK-2細胞,通過Western blot、Bodipy493/503染色、TG定量分析等方法確定Cideb表達水平對腎小管上皮脂肪含量的影響;
　　7)運用Transwe

8、ll培養(yǎng)系統(tǒng)建立腎小管上皮重吸收體外模型,運用3H標記脂肪酸,測定Cideb對脂肪吸收的影響。
　　研究結果:
　　1)Cideb在腎小管上皮細胞中表達,且Cideb敲除小鼠腎臟脂肪含量增高。
　　通過透射電鏡觀察到在小鼠的腎小管上皮細胞中有脂蛋白樣的顆粒存在;免疫組化染色結果顯示Cideb主要分布在腎小管上皮細胞中,且在近端小管中表達水平最高,而腎小球不表達Cideb。apoB在腎臟的表達情況與之類似。Oil Red

9、 O染色和TG定量分析發(fā)現Cideb缺失的小鼠腎臟中脂肪含量明顯增加,結果提示Cideb參與了腎臟的脂肪代謝過程。
　　2)在膜性腎病小鼠模型和膜性腎病患者中,腎小管中Cideb的表達水平明顯升高。
　　在膜性腎病時,腎小球的基底膜發(fā)生破壞,造成腎小球通透性明顯增加,從而增強了腎小管的重吸收功能,因此膜性腎病也成為研究腎小管代謝的重要模型。在本研究中,我們通過尾靜脈建立的小鼠模型和人膜性腎病的穿刺標本,發(fā)現Cideb和apo

10、B的表達均升高。這些結果表明,在腎小管重吸收功能增加時,腎小管上皮細胞中Cideb表達水平增加,且與apoB的升高一致,這提示Cideb與腎小管的重吸收功能有關,且很可能參與了腎小管上皮細胞脂蛋白的代謝過程。
　　3)Cideb能夠抑制腎小管上皮細胞中脂肪儲積,并促進脂肪的分泌過程。
　　用不同濃度棕櫚酸促進腎小管上皮細胞內脂肪的儲積,結果顯示能夠提高細胞內Cideb表達水平。同時,運用腺病毒在HK-2細胞內過表達Cideb

11、,用顯示脂滴的Bodipy493/503染色,結果顯示Cideb過表達能夠降低細胞內TG的含量,減少胞漿內脂滴數量。然而,沉默Cideb可以顯著提高細胞內TG的含量,增加細胞內脂滴數量增加。進一步,運用Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)建立腎小管上皮重吸收體外模型,3H標記的脂肪酸測定腎小管上皮分泌脂蛋白的情況。結果顯示,過表達Cideb能夠抑制HK-2細胞內脂肪儲積速度,促進HK-2細胞脂肪的分泌速度;抑制Cideb能夠造成細胞內脂質儲積,并

12、抑制HK-2細胞的分泌過程。結果提示,Cideb能夠促進腎小管上皮脂肪的分泌過程。
　　結論:
　　本研究首先確定了Cideb主要表達于腎小管上皮細胞,且在腎近曲小管上皮細胞中表達水平最高,且與apoB表達水平和腎小管重吸收功能一致;而Cideb缺失小鼠腎小管上皮細胞中脂肪含量明顯增加。由于膜性腎病時腎小球通透性明顯增加,因此我們在建立膜性腎病小鼠模型基礎上,加上膜性腎病患者的穿刺標本,分析Cideb表達水平與膜性腎病之間的

13、關系,結果顯示Cideb在膜性腎病的腎小管上皮細胞中表達水平明顯升高,并與apoB升高一致。為了進一步確定Cideb在腎小管上皮細胞中的具體作用和機制,我們運用過表達和沉默Cideb的腺病毒感染HK-2細胞,結果顯示過表達Cideb能夠抑制細胞內脂質儲積,并促進腎小管上皮細胞脂質的分泌;相反沉默Cideb能夠造成細胞內脂質的儲積,而降低細胞TG的分泌速度。
　　綜上所述,本研究首次確定了Cideb主要表達于腎小管上皮細胞,并可能與