1、乙肝病毒感染是全球性的公共衛(wèi)生問題，在我國危害尤其嚴重。流行病學調查表明，我國人口乙肝病毒的感染率為57．63％，HBsAg陽性者為10．34％，據統(tǒng)計平均每年約有30萬人死于乙肝相關終末期肝病和肝癌。我國慢性乙肝感染有一個特點是對已上市的抗病毒藥物反應低或無應答。目前認為造成抗病毒療效不令人滿意的原因為：①HBV復制模板cccDNA頑固地存在肝細胞核內，現有的抗病毒藥物，對cccDNA無效；②HBV容易變異；③HBV感染引起機體免疫耐

2、受。而慢性乙型肝炎治療的核心問題是抗病毒，因此為了取得更好的治療效果，針對不同的抗HBV的靶位和機制開發(fā)研制新的藥物勢在必行，而且應該具有很好的前景。 乙肝病毒可以從復制、表達、轉錄、轉錄后等多個環(huán)節(jié)調節(jié)自身復制和宿主免疫機能，轉錄調控是基因表達調控的第一步，曾被認為是基因表達的主要調控機制。但是隨著對轉錄后調控越來越多的了解，發(fā)現轉錄后調控在基因表達調控中同樣起著重要作用。轉錄后調控決定著基因表達最終產物的種類和表達量。

3、 HBV轉錄后調控涉及多個環(huán)節(jié)，HBV轉錄后調節(jié)基序(HBVpost-transcriptionalregulatoryelement，HPRE)的作用是其中重要一環(huán)?，F有的研究認為這段序列在轉錄后水平發(fā)揮著順式調節(jié)作用，抑制轉錄體的剪接同時促進轉錄體由細胞核向細胞漿的轉運。雖然HPRE的作用機制至今還不是完全清楚，但是認為HPRE依賴與細胞蛋白的結合來發(fā)揮它的作用，因此驗證HPRE結合蛋白就可以幫助明確HPRE在HBVRNA輸出中發(fā)

4、揮的作用。 為此，本研究擬在已有的研究基礎上，進一步尋找和驗證HPRE結合蛋白，希望能夠找到新的HPRE結合蛋白，特別是抑制性結合蛋白，并以此為基礎去探索HPRE與其結合蛋白在HBV感染后在機體內復制過程中所發(fā)揮的重要作用及作用機制，希望能夠找到一條新的途徑可以完全阻斷HBV復制，為開發(fā)抗HBV感染新藥提供新的思路和靶位。 第一部分 用T7一剛A聚合酶體外轉錄合成HBV轉錄后調節(jié)基序 目的：構建體外轉錄的模板。利

5、用T7-RNA聚合酶，以體外轉錄的方法在體外制備足量、高純度的HBV轉錄后調節(jié)基序(HBVpost-transcriptionalregulatoryelement，HPRE)，為進一步篩選HPRE相互作用蛋白奠定基礎。 方法：與本實驗室保存的HBV全基因組序列進行比對和同源性分析后，自行設計引物，用PCR的方法得到HPRE基因片段。將PCR產物插入質粒pGEM．1lzf的內切酶位點EcoRI，構建重組質粒pGEM-nzf-HP

6、RE。用內切酶XholI對重組質粒進行酶切后，以線性化的重組質粒pGEM—llz~HPRE為模板，利用T7-RNA聚合酶，以體外轉錄的方法在體外合成HPRE，通過RNA電泳和分光光度計分析得到的HPRE的質和量。 結果：用PCR技術成功地以含HBV全基因組的重組質粒pGEM-luc-HBV為模板獲得HPRE基因片段，長度為636bp。并且成功地將該片段插入質粒pGEM—llzf的多克隆位點，構建了重組質粒pGEM-¨zf-HPR

7、E，經酶切和測序鑒定正確。以線性化的重組質粒pGEM-¨zf-HPRE為模板，利用T7-RNA聚合酶，以體外轉錄的方法在最佳的條件下合成HPRE，RNA電泳證實其片段大小與預期值相符，分光光度計定量得到的RNA是DNA模板量的四十余倍。 結論：我們建立了理想的體外轉錄體系，并且可以進一步擴大反應體積，制備出我們研究所需要的足量的HPRE。 第二部分 從人肝細胞cDNA噬菌體表面展示文庫中篩選llpRE相互作用蛋白

8、 目的：從人肝細胞的cDNA噬菌體表面展示文庫中篩選和富集與HPRE相互作用的特異性噬菌體克隆，再通過生物信息學方法獲取HPRE相互作用蛋白的相關序列信息。 方法：通過噬菌體滴度分析和PCR評價原始cDNA文庫質量。以HPRE為靶分子，經三輪篩選人肝細胞的cDNA噬菌體表面展示文庫。同樣利用結合噬菌體滴度分析和PCR法評價各輪篩選后的特異性富集效果，對特異性富集的噬菌體cDNA插入片段進行序列測定和生物信息學分析。 結果

9、：對購買的人肝細胞cDNA噬菌體表面展示文庫進行噬菌體滴度分析，結果表明原始cDNA文庫中包含的獨立重組子克隆數高達5．97x10一，具有較高的庫容量。隨機挑取原始cDNA文庫中的重組子單克隆進行PCR鑒定，結果表明插入cDNA片段長度大小不一，能夠較好地代表起源細胞中mRNA的種類和豐度。 人肝細胞cDNA噬菌體表面展示文庫經過三輪篩選后，噬菌體滴度分析表明隨著淘洗次數的增加噬菌體滴度都有所增加，證明每一輪篩選后與HPRE特異

10、性結合的陽性克隆明顯增多，特異性的陽性克隆經過篩選后得到富集。對三輪篩選后噬菌體的cDNA插入片段進行PCR分析，結果顯示絕大多數PCR產物都為相同長度(約350bp)，測序結果表明不同克隆的350bpPCR產物序列完全一致，證實經過三輪篩選后含有特定cDNA插入片段的克隆得到富集。測序結果在NCBI的EST數據庫中進行同源性搜索和比對(BLAST)，發(fā)現TIAlcytotoxicgranule-associatedRNA-bindin

11、gprotein-likelisoform2variantprotein與我們的序列同源性最高。 結論：特異性富集和分離出表達HPRE相互作用蛋白的噬菌體克隆，并獲得相應的蛋白質序列信息，證明與HPRE相互作用的蛋白可能為TIAl。 第三部分 體外驗證HPRE和TIA1的相互作用 目的：在體外證明TIAl與HPRE能夠發(fā)生結合，并通過初步的功能實驗，證明二者的結合是特異性結合。 方法： 1．通過體

12、外轉錄技術得到HPRE，通過原核表達、谷胱甘肽一瓊脂糖樹脂純化得到融合蛋白TIAl一GST。將融合蛋白TIAl—GST與HPRE進行結合反應，并同時以HPRE和蛋白GST作為陰性對照。反應產物行PAGE電泳，然后直接用EB染色后顯色，觀察結果。 2．利用質粒pDMl38和pDMl38-PRE，將TIAl的真核表達質粒pCDNA3-FLAG-TIAl和上述兩個質粒分組，按照一定比列轉染細胞HepG2，通過ELISA檢測報告基因CA

13、T的表達和統(tǒng)計學分析來對TIAl與HPRE的相互作用進行功能鑒定。 結果： 1．融合蛋白TIAl一GST與HPRE進行結合反應后，電泳可見與蛋白質發(fā)生結合形成復合體的HPRE與未與蛋白質形成復合體的HPRE移動速度存在明顯差異，而陰性對照則無此現象，說明融合蛋白與HPRE發(fā)生了結合反應。 2．檢測報告基因CAT的表達量，結果顯示：轉染質粒pDMl38-PRE的細胞較轉染質粒pDMl38的細胞能顯著增加CAT表達量