1、本研究針對該病病原對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV),建立了組織病理、核酸探針、PCR及IHHNV與對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)的多重PCR檢測技術(shù).其中對攜帶IHHNV的凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)受感染細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)典型的CowdryA(CowdrytypeA)型包涵體,為證實(shí)這一結(jié)論,本研究根據(jù)Genbank登錄的IHHNV基因序列(AF218266),設(shè)計了一對特異性引物,

2、從純化的IHHNV DNA和攜帶IHHNV凡納濱對蝦組織DNA中成功地擴(kuò)增出產(chǎn)物大小為703bp的DNA片段,該對引物對IHHNV DNA的檢測靈敏度為19.85fg(相當(dāng)于8.83×10<'3>個病毒拷貝),與健康對蝦組織DNA、WSSV DNA及對蝦肝胰腺細(xì)小病毒(HPV)DNA均無交叉反應(yīng).在已建立的IHHNV PCR檢測方法的基礎(chǔ)上利用非放射性標(biāo)記物地高辛(DIG)制備了DNA探針,通過核酸探針斑點(diǎn)雜交檢測方法對此探針特異性及靈

3、敏度進(jìn)行驗(yàn)證.根據(jù)對上述建立的各診斷方法檢測結(jié)果的綜合分析,從而確認(rèn)了本研究采集的凡納濱對蝦樣品受IHHNV感染的結(jié)論.IHHNV與WSSV的多重PCR反應(yīng)體系可同時擴(kuò)增WSSVDNA和IHHNV DNA,且對健康對蝦組織DNA及HPV DNA無任何條帶出現(xiàn).該系統(tǒng)對WSSV DNA的檢測靈敏度為2.6pg,相當(dāng)于7.70×10<'3>個病毒拷貝;對IHHNV DNA的檢測靈敏度為99.25fg,相當(dāng)于4.38×10<'4>個病毒拷貝.

4、比單—PCR檢測靈敏度低10倍.為消除實(shí)驗(yàn)室核酸污染,將中國對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)病毒液分別與萬福金安含氯消毒劑、高錳酸鉀、甲醛、過氧化氫、甲酚皂、酒精和氯仿作用.不同濃度消毒劑與病毒液作用不同時間后提取DNA作病毒核酸斑點(diǎn)雜交檢測.應(yīng)用PCR檢測技術(shù)對2001-2004年我國沿海部分養(yǎng)殖地區(qū)對蝦及其餌料和環(huán)境生物攜帶IHHNV及WSSV情況進(jìn)行了調(diào)查,調(diào)查結(jié)果顯示,在281份被檢對蝦樣品包括凡納濱對蝦、細(xì)角濱對蝦(Litope

5、naeus stylirostris)、中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)和日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus))中,IHHNV攜帶的對蝦品種均為凡納濱對蝦,陽性率達(dá)54.8％,幼蝦(Juvenile)和仔蝦(Postlarvae)樣品攜帶IHHNV的陽性比率較高;餌料和環(huán)境生物鹵蟲(Artemia)、沙蠶(Nereidae)、輪蟲(Rotatoria)、橈足類(Copepoda)、絨螯近

6、方蟹(Hemigrapsuspenicillatus))的檢測結(jié)果顯示絨螯近方蟹樣品呈IHHNV陽性;日本對蝦、凡納濱對蝦和絨螯近方蟹中均可檢出WSSV,陽性率為40.9％,幼蝦和成蝦攜帶WSSV的陽性比率較高.本研究結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)在自然狀態(tài)下養(yǎng)殖凡納濱對蝦和蟹類可同時攜帶IHHNV和WSSV兩種病毒.證實(shí)我國養(yǎng)殖凡納濱對蝦確實(shí)攜帶有IHHNV,在自然狀態(tài)下該病毒能否在我國其它養(yǎng)殖對蝦品種和環(huán)境生物中傳播并流行,及其在我國的分布情況和造成