1、肌動蛋白在真核生物中廣泛存在,由肌動蛋白參與形成的動態(tài)微絲骨架系統(tǒng)是細胞生命活動的基礎.在植物細胞中,肌動蛋白由多基因家族編碼,從而產(chǎn)生了多種肌動蛋白異型體.肌動蛋白異型體在植物體內(nèi)的表達具有組織特異性,在植物生長發(fā)育的不同階段具有不同的表達模式,從而發(fā)揮不同的功能,它們與眾多肌動蛋白結(jié)合蛋白也具有不同的相互作用.因此,體外研究植物肌動蛋白異型體理化特性將對深入了解它們在體內(nèi)的功能及其動態(tài)調(diào)節(jié)具有重要意義.熒光標記技術雖然廣泛用于細胞內(nèi)

2、微絲骨架分布及其動態(tài)的研究,但傳統(tǒng)的熒光標記方法用于植物肌動蛋白研究時都具有一定的局限性,利用GFP融合以及研制新型的藻熒光探針有助于對植物肌動蛋白的深入了解.利用基因融合技術,原核表達并從包涵體中純化了豌豆肌動蛋白異型體PEAc1、His-taggedPEAc1、His-tagged GFP以及His-tagged PEAc1-GFP,并通過誘導條件的篩選達到了可溶性表達與大量純化His-tagged PEAc1-GFP的目的.利用圓

3、二色譜法對肌動蛋白二級結(jié)構(gòu)的測定表明:與預測值相比,可溶性表達與純化的His-tagged PEAc1-GFP具有更為合理的二級結(jié)構(gòu),His-GFP-tag的融合促進了PEAc1的可溶性表達與正確折疊.這一方法可能是解決植物肌動蛋白及其他在包涵體中表達蛋白難以正確折疊和大量純化的有效途徑之一.對純化的上述肌動蛋白的聚合活性進行了詳細研究.熒光標記結(jié)合熒光顯微觀察表明:從可溶性上清中純化的His-tagged PEAc1-GFP聚合形成的

4、微絲不僅可以直接在熒光顯微鏡下觀察,也可被微絲的特異標記物鬼筆環(huán)肽所標記,而且其直徑、長度以及形態(tài)上與已知的聚合肌動蛋白熒光絲一致;電鏡負染的結(jié)果進一步證實其直徑為9nm,與傳統(tǒng)微絲直徑相當(7-10nm);聚合曲線有明顯的停滯期,為典型的S型聚合曲線,聚合臨界濃度為0.75μmol/L,這一結(jié)果與已有報道相似.上述結(jié)果表明,通過GFP的融合而在大腸桿菌中可溶性表達的PEAc1,不僅很好保持了肌動蛋白的聚合活性,而且GFP的熒光特性也方

5、便了微絲體外特性的研究.通過肌動蛋白體外對DNase I以及肌球蛋白ATPase活性影響的研究,發(fā)現(xiàn)單體His-taggePEAc1-GFP能顯著抑制DNase I活性,在肌動蛋白聚合條件下能有效激活肌球蛋白ATPase活性,這一結(jié)果預示著PEAc1在體內(nèi)可能參與相關的生命活動,為利用GFP直接與肌動蛋白異型體融合來研究體內(nèi)微絲的動態(tài)變化及其調(diào)節(jié)提供了實驗依據(jù).以原核表達的PEAc1為抗原制備了免疫活性較好的抗豌豆肌動蛋白的多克隆抗體,

6、從螺旋藻中純化了高純度、高活性、能結(jié)晶的藻膽蛋白,將兩者偶聯(lián)制備的藻熒光探針,不僅保持了藻膽蛋白很強的抗熒光淬滅能力,而且用于豌豆卷須氣孔細胞熒光標記時有更低的熒光背景.對豌豆肌動蛋白藻熒光探針的初步研究,不僅為豌豆肌動蛋白的免疫熒光檢測提供了便利條件,而且通過改變抗體,則可以將藻熒光探針用于其他植物蛋白的標記,藻熒光探針優(yōu)越的熒光特性使其在植物材料的免疫熒光檢測中具有廣闊的應用前景.對藻藍蛋白兩個亞基基因的克隆、原核表達與純化及其熒光