1、近幾年，由多種病原共作用引起的水貂多重感染頻繁出現(xiàn)，其發(fā)病原因復(fù)雜，臨床癥狀不典型，給水貂疫病的預(yù)防和治療帶來(lái)極大的困難，也是制約當(dāng)前水貂養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素。所以，本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室2010年3月至2014年2月接診的山東地區(qū)的241份發(fā)病貂和病死貂進(jìn)行了病原學(xué)檢測(cè)和鑒定，并對(duì)主要病原菌綠膿桿菌的生物學(xué)特性做了進(jìn)一步研究，制備了以松花粉多糖為佐劑的全菌體滅活苗。
　　研究?jī)?nèi)容包括以下三個(gè)部分:
　　第一部分水貂多重感染的病原學(xué)

2、分析
　　為了掌握引起水貂多重感染的主要病原及其特點(diǎn)，本研究分別從細(xì)菌性病原和病毒性病原兩個(gè)方面對(duì)接診的病死貂進(jìn)行了病原學(xué)的分離鑒定。細(xì)菌性病原主要是通過(guò)染色鏡檢、分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)和16SrRNA基因序列同源性分析來(lái)進(jìn)行分離鑒定;病毒性病原則主要通過(guò)雞胚接種，以及對(duì)主要病毒的特異性PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列進(jìn)化分析等方法進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果表明山東地區(qū)引起水貂發(fā)病的主要病原有:犬瘟熱病毒(25.3％)、細(xì)小病毒(25.3％)、阿留申病毒(

3、19.1％)、綠膿桿菌(49.0％)、克雷伯氏菌(19.9％)、大腸桿菌(11.2％)、奇異變形桿菌(8.3％)、以及巴氏桿菌(5.0％)和肺炎雙球菌(2.5％)。對(duì)主要病原進(jìn)行系統(tǒng)性統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)山東地區(qū)水貂感染主要以病原的單獨(dú)感染(46.0％)和二重感染(44.4％)為主，三重感染(7.9％)次之，四重感染(1.24％)和五重感染(0.41％)較少。
　　第二部分主要病原綠膿桿菌的生物學(xué)特性分析
　　從上述病死貂的病原學(xué)

4、檢測(cè)結(jié)果可知，綠膿桿菌是引起山東地區(qū)水貂多重感染的主要病原菌。為了迸一步了解其生物學(xué)特性，本研究對(duì)其進(jìn)行了免疫型鑒定，以確定主要流行菌株的免疫型，并對(duì)其進(jìn)行了藥物敏感性檢測(cè)，來(lái)確定各免疫型菌株對(duì)藥物敏感性的差異及其敏感藥物，還對(duì)各免疫型菌株的LD50進(jìn)行了測(cè)定，來(lái)比較各免疫型菌株的毒力強(qiáng)弱。結(jié)果顯示:118株綠膿桿菌分為3種免疫型:G型(89/118)、B型(21/118)和Ⅰ型(3/118);118株綠膿桿菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，

5、受試的12種常用抗菌藥物中，對(duì)氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素和阿米卡星的敏感性較高;對(duì)阿莫西林、林可霉素和利福平耐藥，而且對(duì)抗生素的敏感性與菌株的免疫型無(wú)明顯關(guān)系;經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證明，3種免疫型菌株毒力均不同，B型和Ⅰ型菌株毒力均較G型弱，G、B和Ⅰ免疫型菌株的LD50分別為:8×106 cfu、4.5×107 cfu、2.5×108 cfu。
　　第三部分綠膿桿菌松花粉多糖佐劑滅活苗的研制
　　從以上試驗(yàn)結(jié)果可知，G免疫型綠膿桿

6、菌是引起水貂多重感染的主要病原，本實(shí)驗(yàn)室多年的研究結(jié)果顯示，松花粉多糖具有很好的免疫調(diào)節(jié)和殺菌消毒作用。所以，本研究以松花粉多糖為佐劑，制備了G免疫型綠膿桿菌的全菌體滅活苗。試驗(yàn)將24只7周齡清潔級(jí)小白鼠，均分為3組，分別記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，Ⅰ組注射綠膿桿菌全菌體白油司班佐劑滅活苗;Ⅱ組注射添加松花粉多糖佐劑的綠膿桿菌全菌體滅活苗;Ⅲ組注射相同劑量的生理鹽水。在免疫后第3d、7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d和56d，分

7、別對(duì)三組實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行采樣，用建立的ELISA方法檢測(cè)采集的血清抗體效價(jià)，用全血分析法來(lái)檢測(cè)淋巴細(xì)胞比率，用MTT法來(lái)檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，用IL-2 ELISA試劑盒來(lái)檢測(cè)IL-2的含量。結(jié)果顯示:松花粉多糖佐劑綠膿桿菌全菌體滅活苗安全性良好，最佳免疫劑量為0.3ml，免疫保護(hù)率為90％，Ⅱ組各免疫指標(biāo)均顯著高于其他兩組(P＜0.05)，表明本研究制備的松花粉多糖佐劑綠膿桿菌全菌體滅活苗對(duì)G型綠膿桿菌流行菌株具有很好的預(yù)防作用。