1、<p>　　2012屆 分 類 號：</p><p>　　單位代碼：10452</p><p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p>　　雙水相萃取法在中藥有效成分提取中的研究進展</p><p>　　姓

2、 名 徐鳳蓮 </p><p>　　學 號 200809820107 </p><p>　　年 級 2008 </p><p>　　專 業(yè) 制藥工程 </p><p>　　系 （院）

3、 化學化工學院 </p><p>　　指導教師 莊會榮 </p><p><b>　　年 月 日</b></p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本

4、文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本本文本文。</p><p>　　本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本

5、文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本。</p><p>　　本文本文本文本文本文本文本文

6、本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本文本。</p><p>　　關鍵詞：本文；本文本文；本文本文</p><p><b&

7、gt;　　ABSTRACT</b></p><p>　　An alternative process was developed to prepare smaller and nearly monodispersed thiol-stabilized platinum nanoparticles. without the addition of concentrated hydrochloric ac

8、id that was previously reported as essential for the transfer to take place.</p><p>　　An alternative process was developed to prepare smaller and nearly monodispersed thiol-stabilized platinum nanoparticles.

9、 The procedure involves the reduction of a Pt(IV) particle size distribution and excellent stability in aqueous solutions.</p><p>　　Keywords: Platinum; Platinum; Platinum</p><p><b>　　目 錄&

10、lt;/b></p><p>　　1 基因治療研究與應用概述·····························&

11、#183;····································

12、;··································1</p>&l

13、t;p>　　1.1 特異性外源基因的獲得·································

14、;····································

15、83;···························1</p><p>　　1.1.1 用分子生物學技術分離與克隆··

16、····································

17、3;····································&#

18、183;·3</p><p>　　1.1.2 用限制性內切酶酶切····························

19、83;····································&

20、#183;···························3</p><p>　　1.1.3 人工合成目的基因片段··&

21、#183;····································

22、;····································

23、83;·············4</p><p>　　1.1.4 采用逆轉錄法獲得Cdna················&

24、#183;····································

25、;···································4</p&g

26、t;<p>　　2 關于基因治療的倫理學問································

27、····································

28、3;·······························5</p><p>　　2.1 基因治療

29、的必要性····································

30、····································

31、3;································5</p><p>　　2.

32、2 基因治療與人口的老齡化問題··································&

33、#183;····································

34、;··············5</p><p>　　附錄··················&

35、#183;····································

36、;····································

37、83;····································&

38、#183;············6</p><p>　　參考文獻···················&

39、#183;····································

40、;····································

41、83;····································&

42、#183;···8</p><p>　　謝辭····························

43、83;····································&

44、#183;····································

45、;····································

46、83;··9</p><p>　　1 基因治療研究與應用概述</p><p>　　基因治療(gene therapy)是通過基因轉移技術將外源正?；驅氩∽儾课坏陌屑毎⒘钇溆行П磉_，以糾正或補償基因缺失或異常，從而起到治療疾病作用的一種新型醫(yī)療方法[1]。</p><p>　　1.1 特異性外源基因的獲得獲得</p><p

47、>　　基因治療(gene therapy)是通過基因轉移技術將外源正?；驅氩∽儾课坏陌行歪t(yī)療方法[1]。</p><p>　　1.1.1 用分子生物學技術分離與克隆</p><p>　　基因治療(gene therapy)是通過基因轉移技術將外源正?；驅氩∽儾课坏陌屑毎⒘钇溆行П磉_,以糾正或補償基因缺失或異常,從而起到治療疾病作用的一種新型醫(yī)療方法[1]。</p>

48、;<p>　　1.1.2 用限制性內切酶酶切</p><p><b>　　……</b></p><p>　　1.2 靶細胞的分離與體外培養(yǎng)</p><p>　　靶細胞是接受外源基因的細胞。從被治療對象體內取得靶細胞進行培養(yǎng)、增殖,以獲得足夠的靶細胞來接受外源基因。其它類型的體細胞如骨髓細胞、皮膚成纖維細胞、角質細胞、肝細胞和血管內

49、皮等均可用于基因治療①。</p><p><b>　　……</b></p><p>　　正文部分字數(shù)不少于4000字</p><p>　　表1 基因治療的必要性</p><p>　　注：表示與對照組相比p<0.05</p><p><b>　　正文</b></p&

50、gt;<p><b>　　0.引言</b></p><p>　　中藥是我們中華民族的瑰寶，是我國勞動人民幾千年來在與疾病作斗爭的過程中，不斷認識、逐漸積累起來的。中藥我國古代人們戰(zhàn)勝疾病最重要的武器，對于中華民族的繁榮昌盛有著巨大的貢獻。</p><p>　　為了方便研究，需要中藥中的有效成分提取分離出來。目前國內外的提取分離技術已經非常成熟，而且提取技

51、術的種類也多種多樣。提取方法有浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法、水蒸氣蒸餾法、升華法、超臨界萃取法等。分離方法有兩相溶劑萃取法、分配色譜法、凝膠過濾法、膜分離法、離子交換法、分餾法等。本文著重介紹的是雙水相萃取技術。</p><p>　　1.雙水相萃取法的現(xiàn)狀</p><p>　　雙水相萃取技術是近年來發(fā)展起來一的種新型的液-液萃取技術，引起了人們極大的重視。雙水相現(xiàn)象是

52、由Beijeronck在1896年將瓊脂水溶液與可溶性淀粉或明膠水溶液混合時最先發(fā)現(xiàn)的，雙水相萃取技術真正應用是在1956 年，即由瑞典倫德大學的 Albertsson 成功的運用雙水相體系分離葉綠素。20世紀70年代,科學家又發(fā)展了雙水相萃取在生物分離過程中的應用，為蛋白質特別是胞內蛋白質的分離和純化開辟了新的途徑。目前已廣泛應用于物質的分離、純化，因為雙水相萃取技術是一種高效、溫和而又易操作的分離技術。迄今為止，已被成功的應用于生物

53、醫(yī)藥工程，天然產物分離純化等方面。尤其是，雙水相萃取技術在中草藥有效成分分離純化中的應用已經越來越得到人們的關注，也是當前研究的熱門。</p><p>　　2.雙水相萃取法的基本概念</p><p>　　2.1雙水相萃取法的原理</p><p>　　2.2雙水相萃取法的特點</p><p>　　雙水相萃取法同傳統(tǒng)的萃取方法一樣，都是利用物質在

54、兩相間的分配系數(shù)不同而實現(xiàn)分離的。但雙水相有其獨特之處，譬如，雙水相萃取法操作條件很溫和，常溫常壓操作，不會引起生物活性物質失活或變性；對目標物的選擇性強，分離過程簡單，易于工業(yè)放大和連續(xù)操作；不存在有機溶劑殘留、萃取時間短、經濟等優(yōu)點。聚合物的濃度、無機鹽的種類和濃度，以及體系的pH 值等多種因素都可以對被萃取物質在兩相的分配產生影響，因此可以利用多種手段來使反應達到最佳條件,這也是利用雙水相萃取法提取中藥有效成分的試驗進行研究的重要

55、部分。</p><p>　　3.雙水相萃取法的應用</p><p>　　3.1. 雙水相萃取法在黃酮類提取中的應用</p><p>　　3.1.1.雙水相體系萃取分離杜仲黃酮</p><p>　　彭勝, 彭密軍等以高分子化合物聚乙二醇4000( PEG4000) /葡聚糖40000( D40)為雙水相體系萃取分離杜仲黃酮,實驗探討了在保證杜仲

56、黃酮與色素及其他雜質有效分離的情況下, 使得杜仲黃酮盡可能轉移到下相, 從而達到最高提取率。由于雙水相萃取法側重的是如何提高目標產物萃取率, 而忽略了目標成分與雜質的分離問題。本實驗則運用PEG/D40體系, 在保證分離效果的前提下, 系統(tǒng)地考察了該體系對杜仲黃酮的純化情況, 旨在為杜仲黃酮的分離純化和開發(fā)利用提供新方法。實驗證明以11%PEG4000-8%D40作為杜仲黃酮的雙水相萃取體系, 最佳條件為: 樣品溶液8g, pH值為8,

57、 溫度60℃。加入杜仲黃酮含量為6.85%的樣品溶液8g, 控制溫度為60℃ 、溶液pH為8。此條件下杜仲黃酮的萃取率 可達到75.82%。</p><p>　　3.1.2.雙水相系統(tǒng)純化山楂葉中黃酮</p><p>　　趙立輝等應用以水、乙醇和硫酸銨三者所形成的雙水相系統(tǒng)，以脫除其中一些易溶于水和在高濃度乙醇中溶解度低的物質。并測定了以氯化銨、磷酸氫二鈉、結晶碳酸鈉和硫酸銨以及其加入量對

58、分相的影響。其中，氯化銨的加入量對分相基本沒有什么影響，而硫酸銨隨著量的增加, 黃酮的百分含量逐漸增加, 損失率在逐漸減小。實驗測得：在乙醇4mL+水5mL+硫</p><p>　　酸銨5g+0.15g粗體物時所得到的黃酮含量最高,達到了50.9%, 同時回收率為81.6%; 在乙醇5mL+水5mL+硫酸銨5g+0.15g粗體物時可以得到最高的回收率89.2%, 并且此時的黃酮含量為47.6%。這是因為鹽量越大時

59、鹽析作用越大, 上相的乙醇濃度就會越高, 所以含量也會隨之增加, 回收率回隨之升高。但硫酸銨加入量為5g始已經達到飽和的狀態(tài),所以硫酸銨的最大加入量為5g。</p><p>　　3.1.3.雙水相體系提取竹葉總黃酮</p><p>　　左光德等利用超聲提取法和雙水相分離技術相結合的方法提取竹葉總黃酮，并研究硫酸銨和丙醇含量、超聲時間以及液固比對黃酮提取率的影響。經試驗找出分離的最佳雙水相體

60、系為:丙醇體積分數(shù)60%;(NH4)2SO4用量為0.35g/ml；隨著超聲時間的增加, 竹葉總黃酮提取率增大, 25min時竹葉總黃酮提取率達到最大, 之后隨超聲時間的增加總黃酮得率反而略有減少；在液固比為30：1的條件下,竹葉總黃酮提取率為2.03%,提取物中總黃酮純度為31.3%,明顯高于常規(guī)超聲法。即此新方法的最佳實驗條件為：超聲時間25min、液固比為30：1。實驗證明了超聲與丙醇-硫酸銨雙水相體系耦合法可以縮短提取時間、提高

61、得率，具有良好的應用前景,值得推廣應用。</p><p>　　付艷麗等以超聲提取技術與丙醇-硫酸銨雙水相萃取體系進行耦合的方法，從傣族雅解藥竹葉蘭中提取總黃酮物質。并且運用Design Expert軟件進行星點設計響應面分析法進行優(yōu)化，來探討竹葉蘭總黃酮最佳提取工藝。得出竹葉蘭總黃酮最佳提取條件為:丙醇濃度為55% ，超聲時間為50min ，硫酸銨用量20%，總黃酮得率為3.53%。此結果充分說明了用該方法設計的

62、最佳提取工藝的可靠性。</p><p>　　3.2. 雙水相萃取法在苷類提取中的應用</p><p>　　3.2.1.雙水相萃取法分離黃芩苷</p><p>　　趙愛麗等選擇非離子表面活性劑聚乙二醇( PEG)-K2HPO4-H2O雙水相體系對黃芩苷進行富集,探究成相條件及溫度, pH值,聚合物的分子量等不同因素對黃芩苷得率的影響。實驗表明利用PEG6000/K2H

63、PO4 雙水相體系, 最大的分配系數(shù)可達29.8, 最大收率98.6%。黃芩苷大部分被分配在PEG相中。另外結果表明PEG的平均分子量愈大, 黃芩苷愈趨向于上相分配，即兩相中親水性差距增大,黃芩苷在上相中的分配率增大；pH值過高對黃芩苷在雙水相中分配不利；溫度對R和Y影響不很大, 但對分配系數(shù)K影響較大。試驗得出最佳的分離條件為：PEG6000質量分數(shù)為26%, K2HPO4的質量分數(shù)18%, pH值為7. 0, 溫度為30℃。<

64、/p><p>　　3.2.2. 雙水相萃取法提取橙皮苷</p><p>　　文赤夫等研究橙皮苷在丙酮-(NH4)2SO4-H2O雙水相體系中的分配特性及影響萃取率的因素。通過試驗表明在90%丙酮與(NH4)2SO4 溶液體積各為10ml 的情況下，萃取效率最佳的條件為：(NH4)2SO4 用量4.0g、樣品0.35g、pH為4，其萃取率為98.22%。橘皮中的橙皮苷主要進入有機相中，萃取率為9

65、8.22%。文赤夫等還進行了薄層色譜分析，在365nm紫外燈下，上相溶液與標準品的斑點Rf 值接近，下相溶液檢測不到橙皮苷。</p><p>　　3.2.3. 雙水相體系萃取分離桃葉珊瑚甙</p><p>　　彭勝等利用由高分子化合物聚乙二醇( PEG4000)與葡聚糖40000(D40)所形成的雙水相體系萃取分離杜仲葉中桃葉珊瑚甙。經試驗驗證表明,最佳體系為是由質量分數(shù)為11%PEG40

66、00和8%D40組成, 最佳萃取條件是樣品8g, pH值為7,溫度是60℃。他們的研究方法與傳統(tǒng)方法相比,不存在有機溶劑殘留，而且分相時間短、能除去大量雜質和固體物質、易于工程放大和連續(xù)操作等優(yōu)點，對于生產操作具有重大意義。</p><p>　　3.3雙水相萃取法在酶類提取中的應用</p><p>　　3.3.1. 雙水相萃取法提取過氧化物酶</p><p>　　黃

67、燕華等研究了雙水相萃取法應用于從白蘿卜中快速提取過氧化物酶的可行性。通過雙水相萃取法與傳統(tǒng)鹽析法的比較得出在比活方面?zhèn)鹘y(tǒng)鹽析法所得酶約為雙水相萃取法所得酶的1. 4倍,但在酶力方面雙水相法酶蛋白的得率更高, 約為鹽析法的1. 8倍。綜合考慮聚乙二醇/硫酸銨雙水相萃取法更具有操作意義，具有操作簡單、快速、提取率高等優(yōu)點。并且聚乙二醇可以回收再利用，十分經濟環(huán)保，適合于工業(yè)化大生產以及對白蘿卜的開發(fā)與利用。</p><p

68、>　　3.3.2. 雙水相萃取法萃取生姜蛋白酶</p><p>　　謝芳等以生姜為原料，研究雙水相萃取技術分離提取生姜中生姜蛋白酶的提取條件。根據(jù)單因素試驗，選取PEG濃度、磷酸緩沖液pH、磷酸緩沖液濃度3個因素進行正交試驗，由方差分析可知，磷酸緩沖液pH和磷酸緩沖液濃度對萃取結果影響均為差異顯著。利用單因素試驗與正交試驗進行優(yōu)化，探究到最佳萃取方案為PEG分子量為4000，PEG濃度為20％，緩沖鹽pH為

69、6.5，緩沖鹽濃度為10％。</p><p>　　3.3.3. 雙水相體系提取無花果蛋白酶</p><p>　　馮自立等擴展雙水相萃取方法應用領域，對PEG(polyethylene glycol)/(NH4)2SO4雙水相體系萃取無花果葉中無花果蛋白酶的實驗條件進行研究。通過對不同相對分子質量PEG相圖的繪制，獲得了PEG/(NH4)2SO4 體系組成基礎數(shù)據(jù)。實驗結果表明：兩相體系中P

70、EG相對分子質量為1000、PEG質量分數(shù)為20%、(NH4)2SO4 質量分數(shù)為19%、pH值為6、溫度25℃時蛋白酶在兩相體系中分配系數(shù)最高。</p><p>　　3.3.4.雙水相萃取法提取殼聚糖酶</p><p>　　周念波等采用PEG-( NH4)2SO4雙水相體系直接從Bacillus sp. LS發(fā)酵液上清液中分離殼聚糖酶。研究了體系中PEG分子量、PEG質量分數(shù)、( NH4

71、)2SO4質量分數(shù)、NaCl 質量分數(shù)和pH值對殼聚糖酶分配系數(shù)及萃取率的影響。實驗數(shù)據(jù)反映出：隨著PEG相對分子量的增加, 殼聚糖酶的分配系數(shù)和萃取率均先增大后減小, 當PEG相對分子量為600時分配系數(shù)和萃取率均達到最大；（NH4) 2 SO4質量分數(shù)一定時, 隨著PEG600質量分數(shù)的增加, 分配系數(shù)和萃取率均先增大后減?。籔EG600質量分數(shù)一定時, 隨著( NH4)2SO4質量分數(shù)的增加, 分配系數(shù)和萃取率均先增大后減??；隨著

72、pH值的增加, 分配系數(shù)和萃取率均先增大后減小, pH值為6.0時, 均出現(xiàn)最大值。在此條件下殼聚糖酶分配系數(shù)達5.91, 萃取率達88.7%。</p><p><b>　　3.4.</b></p><p>　　某些親水性高分子聚合物的水溶液超過一定濃度后可以形成兩相，并且在兩相中水分均占很大比例，即形成雙水相系統(tǒng)（aqueous two-phase system,A

73、TPS）。利用親水性高分子聚合物的水溶液可形成雙水相的性質，Albertsson于20世紀50年代后期開發(fā)了雙水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又稱雙水相分配法。20世紀70年代,科學家又發(fā)展了雙水相萃取在生物分離過程中的應用，為蛋白質特別是胞內蛋白質的分離和純化開辟了新的途徑。 </p><p>　　雙水相萃取的聚合物不相容性：根據(jù)熱力學第二定律，混合是熵增過程可以自發(fā)進行

74、，但分子間存在相互作用力，這種分子間作用力隨相對分子質量增大而增大。當兩種高分子聚合物之間存在相互排斥作用時，由于相對分子質量較大的分子間的排斥作用與混合熵相比占主導地位，即一種聚合物分子的周圍將聚集同種分子而排斥異種分子，當達到平衡時，即形成分別富含不同聚合物的兩相。這種含有聚合物分子的溶液發(fā)生分相的現(xiàn)象稱為聚合物的不相溶性。 </p><p>　　可形成雙水相的雙聚合物體系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（

75、Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纖維素/葡聚糖。雙水相萃取中采用的雙聚合物系統(tǒng)是PEG/Dx，該雙水相的上相富含PEG，下相富含Dx。另外，聚合物與無機鹽的混合溶液也可以形成雙水相，例如，PEG/磷酸鉀（KPi）、PEG/磷酸銨、PEG/硫酸鈉等常用于雙水相萃取。PEG/無機鹽系統(tǒng)的上相富含PEG,下相富含無機鹽。 </p><p>　　生物分子的分配系數(shù)取決與溶質于雙水相系統(tǒng)間的各種相互作用，其中主要有靜電作用

76、、疏水作用和生物親和作用。因此，分配系數(shù)是各種相互作用的和。 </p><p>　　將2 種不同的水溶性聚合物水溶液（或聚合物與一定濃度的鹽溶液）混合時，當聚合物濃度（或</p><p>　　鹽的濃度）達到一定值，體系會自然分成互不相溶的兩相，這就是雙水相體系。雙水相體系的形成主要是由于高聚物之間的不相溶性，一般認為只要兩聚合物水溶液的憎水程度有所差異混合時就可發(fā)生相分離，且憎水程度相差越

77、大，相分離傾向也就越大。</p><p><b>　　參 考 文 獻</b></p><p>　　[1] 程焉平.轉基因產品的安全性及其對應策略[J].遺傳,2001,(6):577－579.</p><p>　　[2] 徐宗良，劉學禮；瞿曉敏.生命倫理學[M].上海：上海人民出版社,2002.</p><p><

78、b>　　……</b></p><p><b>　　1．專著中的文獻</b></p><p>　　[序號]作者.專著名稱[M]．版本(第１版不加標注)出版地：出版社，出版年，頁碼范圍.</p><p>　　例如：[1] 王敏.怎樣撰寫科技論文[M].沈陽:遼寧人民出版社,1983:63.</p><p>

79、　　2．期（報）刊中的文獻</p><p>　　[序號]作者. 文獻名稱[J]．期刊名稱，年，卷號（期號）:頁碼范圍.</p><p>　　例如: [1]袁慶龍,候文義.顯微硬度研究[J].太原理工大學學報,2001,32(1):51-53.</p><p><b>　　3．論文集</b></p><p>　　[序號]作

80、者.論文題目[C]. 主編. 論文集名. 出版地：出版社，出版年：頁碼范圍.</p><p>　　例如：[11]陳送.五四前后東西方文化問題論戰(zhàn)文選[C].北京:中國社會科學出版社,1985．</p><p><b>　　4．學位論文</b></p><p>　　[序號]作者.題目[D]. 授予單位所在地：授予單位，授予年份.</p>

81、;<p>　　例如：[11]王斌.稀土配合物的光譜和晶體結構[D].北京:北京師范大學化學系,1992.</p><p><b>　　5．專利</b></p><p>　　[序號]專利所有者．專利題名[P]．專利國別：專利號，發(fā)布日期．</p><p>　　例如：[11]姜錫洲.一種溫熱外敷藥制備方案.中國,88105607.3[

82、P].1983-08-12.</p><p><b>　　6．技術標準</b></p><p>　　[序號]標準代號，標準名稱[S]．出版地：出版者，出版年．</p><p>　　例如：[1] GB/T16159-1996，漢語拼音正詞法基本規(guī)則[S].北京:中國標準出版社,1996.</p><p><b>

83、　　7．電子文獻</b></p><p>　　[序號]主要責任者．電子文獻題名[文獻類型/載體類型]．電子文獻的出版或可獲得地址，發(fā)表或更新的期/引用日期(任選)．</p><p>　　對于數(shù)據(jù)庫(database)、計算機程序(computer program)及電子公告(electronic bulletin board)等電子文獻類型的參考文獻，采用下列字母作為標識：數(shù)據(jù)

84、庫[DB]，計算機程序[CP]，電子公告[EB]。對于非紙張型載體的電子文獻，當被引用為參考文獻時需在參考文獻類型標識中同時標明其載體類型。采用以下標識：磁帶(magnetic)[MT], 磁盤(disk)[DK], 光盤[CD], 聯(lián)機網絡(online)[OL]。</p><p>　　例如：[21] 王明亮.中國系統(tǒng)工程[EB/OL].http://www.cajcd.cn/ l,1998-08-16/199

85、8-10-04</p><p>　　注：文獻中的作者數(shù)量低于三位時全部列出；超過三位時只列前三位，其后加“等”字即可；作者姓名之間用逗號分開；中外人名一律采用姓在前，名在后的著錄法。</p><p>　　說明：注釋、參考文獻必有其一，亦可二者兼用，具體要求視不同專業(yè)而定，</p><p><b>　　附 錄</b></p>&l

86、t;p><b>　　附錄1：</b></p><p>　　…………………………</p><p><b>　　附錄2</b></p><p>　　…………………………</p><p>　　技能展示要求提供作品實物（如光盤、設計圖、藝術作品等）及說明書，說明書字數(shù)不少于3000字。 具體

87、格式可以根據(jù)以上格式自行調整。</p><p><b>　　謝 辭</b></p><p>　　××××××××××××××××××××××

88、5;××××××××××××××××××××××××××××××××××××&#

89、215;××××××××××××××××××××××××××××××。</p><p><b>　　年