1、影響梅花鹿產茸量的因素很多，如何克服不良影響因素、以提高產茸量一直是人們追求的目標。了解鹿茸生長發(fā)育調控規(guī)律，可以促進提高鹿茸產量的新技術發(fā)展；開發(fā)操作簡便、結果可靠的選種方法，培育產茸量高的新品種，是提高梅花鹿產茸量的基本手段。鑒于梅花鹿養(yǎng)殖中目前存在的選種方法落后的狀況，本研究以湖北白鹿春實業(yè)有限公司梅花鹿養(yǎng)殖場(n=302)和吉林省東豐縣東豐藥業(yè)股份有限公司養(yǎng)鹿場人工養(yǎng)殖梅花鹿(n=234)種群為研究對象，通過分析生長激素(GH)

2、、褪黑激素Ⅰ型受體a亞型(MTNR1A)基因和雄激素受體(AR)基因的單核苷酸多態(tài)性及其與產茸性狀的關系，尋找SNP位點，為建立梅花鹿產茸性狀分子標記輔助選擇方法奠定基礎；同時，應用生物信息學軟件對已擴增得到的梅花鹿褪黑素受體基因進行蛋白結構與功能分析，為闡明鹿茸生長發(fā)育調控規(guī)律、開發(fā)提高產茸量的新技術奠定基礎。主要研究結果如下：
　　 1.梅花鹿激素及其受體基因多態(tài)性與產茸量的關系
　　 (1)GH基因多態(tài)性及其與產茸

3、量的關系：在2個梅花鹿種群中，發(fā)現GH基因3個突變位點，并被GeneBank收錄，即A176-G176突變(登錄號：GQ438251.1)，A45-G45突變和C139-T139突變(登錄號：GQ438253.1)，A176-G176突變導致StuI限制性內切酶位點的改變。利用PCR-RFLP技術進行基因分型，分析基因的多態(tài)性及其與產茸估測值之間的關系，發(fā)現兩個梅花鹿種群各基因型之間的產茸估測值差異不顯著(P>0.05)；A45-G45

4、突變未引起限制性內切酶位點的改變，因此用AS-PCR引物，進行基因分型。而后將基因的多態(tài)性與產茸估測值之間進行關聯分析，發(fā)現兩個梅花鹿種群各基因型的產茸估測值都沒有差異(P>0.05)；C139-T139突變也未引起限制性內切酶位點的改變，用AS-PCR引物進行基因分型，并分析基因多態(tài)性與產茸估測值之間的關系，發(fā)現在五三梅花鹿種群中各基因型之間的產茸估測值沒有差異(P>0.05)，而在東豐梅花鹿種群中，CT基因型和CC基因型的產茸量估測

5、值顯著高于TT基因型(P<0.05)。
　　 (2)MINR1A基因多態(tài)性及其與產茸量的關系：在2個梅花鹿種群中，MTNR1A基因外顯子2出現3個突變，測定其分子結構后提交并被GeneBank收錄，即C518-T518、G629-C629和C635-T635突變(登錄號：JN038179)。C518-T518突變引起Ecol881酶切位點的改變，利用PCR-RFLP方法進行基因分型，然后分析基因多態(tài)性及其與產茸估測值之間的關系，

6、發(fā)現在兩個梅花鹿種群中各基因型之間的產茸估測值都沒有差異(P>0.05)；在G629-C629處突變能引起Mval酶切位點的改變。利用PCR-RFLP方法進行基因分型，并分析基因多態(tài)性與產茸估測值之間的關系，發(fā)現在五三梅花鹿種群中，CC基因型的產茸估測值顯著高于GC基因型(P<0.05)，GC基因型的產茸估測值顯著高于GG基因型(P<0.05)，而CC基因型與GC基因型之間沒有達到統計學差異水平(P>0.05)。C635-T635突變未

7、引起限制性內切酶位點的改變，所以用AS-PCR引物進行基因分型，然后分析基因多態(tài)性與產茸估測值之間的關系，發(fā)現在兩個梅花鹿種群的各基因型之間，產茸估測值都沒有差異(P>0.05)。
　　 (3)AR基因多態(tài)性及其與產茸量的關系：在2個梅花鹿種群中，AR基因存在2個突變位點，測序后提交并被GeneBank收錄，外顯子3的C75-T75和外顯子8的C256-T256(登錄號：JF719040)位點。C75-T75突變引起RsaⅠ酶切

8、位點改變，利用PCR-RFLP方法進行基因分型，然后分析基因多態(tài)性與產茸估測值之間的關系，發(fā)現在五三梅花鹿群體中，CT基因型的產茸量估測值高于CC基因型(P<0.05)，而CT基因型與TT基因型以及TT基因型與CC基因型之間沒有差異(P>0.05)。在東豐梅花鹿群體中，CT基因型的產茸量估測值高于CC基因型(P<0.05)，而CT基因型與TT基因型以及TT基因型與CC基因型之間沒有差異(P>0.05)；C256-T256突變通過SSCP

9、-PAGE技術進行基因分型，分析基因多態(tài)性及其與產茸估測值之間的關系。發(fā)現該位點僅在五三梅花鹿種群中存在多態(tài)性，但各基因型之間的產茸估測值沒有達到統計學差異(P>0.05)。
　　 2.梅花鹿雄激素受體和褪黑素受體結構分析與功能預測
　　 (1)應用Clustal W多序列比對模式對MTNR1A氨基酸序列與9種其他脊椎動物比對，發(fā)現梅花鹿中該基因編碼的氨基酸序列與其他動物一樣保守，在MTNR1A編碼序列864位的核苷酸由

10、G突變?yōu)镃，導致氨基酸突變。比較G突變前、后所編碼蛋白的理化特性，證明該蛋白非常穩(wěn)定。
　　 (2)分析梅花鹿MTNR1A基因的分子進化樹，發(fā)現MTNR1A基因的進化與其他物種的進化非常一致，梅花鹿和牛屬于反芻動物，故分歧時間晚于鳥類前于高等動物，說明在GPCR進化歷程中，梅花鹿同樣遵循物種分化的規(guī)律。
　　 (3)應用SMART蛋白功能區(qū)域預測軟件，預測MTNR1A編碼序列有7個跨膜區(qū)段，為7次跨膜蛋白，在864bp位

11、點的R288S突變體位于NRF蛋白保守功能區(qū)域。應用神經網絡算法和Hidden Markov models模型，得到了兩種可能的信號肽剪接位點，分別是33-34位和61-62位。
　　 (4)分析MTNR1A基因編碼蛋白的二級結構特征，發(fā)現864bp處唯一引起氨基酸改變的突變，位于第6次跨膜和第7次跨膜之間的細胞外信號分子結合位點區(qū)域的LOOP區(qū)，該區(qū)域暴露于細胞膜之外，是可能參與下游信號分子傳導的功能區(qū)。
　　 (5)

12、分析MTNR1A家族成員，發(fā)現其屬于GPCR家族A成員，與視紫紅質有55%的同源性，突變氨基酸位于細胞外的袢環(huán)位置，可能對褪黑素配體的結合以及激活受體密切相關，說明梅花鹿的褪黑素受體可能存在物種特異性的結合及其激活機制，提示該位點可能是活性位點。
　　 (6)采用IPA蛋白互作網絡分析，發(fā)現MTNR1A除了與其配體褪黑素結合外，還與眾多基因、轉錄因子、接頭蛋白等相互作用，形成復雜的調控網絡。MTNR1A是一類重要的GPCR受體，