1、朱砂葉螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)和二斑葉螨T.urticae Koch屬于蛛形綱Arachnida、蜱螨亞綱Acari、真螨目Acariformes、葉螨科Tetranychidae，是農(nóng)林生產(chǎn)中十分重要的害螨。這兩種葉螨具有多種擴散機制，由于葉螨無翅，通常依靠爬行進行擴散;但它們也可以借助風和人類活動進行遠距離的傳播;葉螨復雜的擴散機制可能導致復雜的種群遺傳結(jié)構(gòu)。但是，由于這兩種葉螨體內(nèi)可

2、用的分子標記較少，導致我國這兩種葉螨的種群遺傳多樣和種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究相對滯后。此外，在中國，朱砂葉螨與二斑葉螨兩種葉螨并存，紅色型被認為是本地種，而綠色型的變種被認為是入侵種。朱砂葉螨和二斑葉螨在歐美被認為是二斑葉螨的不同色型，因為兩者可以自由交配，形態(tài)學和線粒體DNA水平上難以找出差別;而在中國等亞洲國家兩者被認為是兩種不同的螨類，理由是成螨體色差異較大，遺傳雜交實驗常得到不親和的結(jié)果。二者的分類地位一直存在較大爭論。
　　

3、 針對以上問題筆者首先通過抑制PCR的方法成功構(gòu)建了微衛(wèi)星富集文庫來，開發(fā)葉螨微衛(wèi)星分子標記;并結(jié)合以前報道的微衛(wèi)星分子標記研究了我國25個地理種群的二斑葉螨和朱砂葉螨的種群遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)，比較了兩者種群遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)的差異，并從種群生態(tài)學的角度探討朱砂葉螨與二斑葉螨的分類進化地位，獲得以下結(jié)果與結(jié)論:
　　 1)通過葉螨的基因組DNA提取純化、酶切、接頭連接及抑制PCR擴增等步驟成功構(gòu)建了二斑葉螨微衛(wèi)星富集

4、文庫，挑取180個陽性克隆成功測序，并設計了53對微衛(wèi)星引物，最后成功獲得2個多態(tài)性較好的微衛(wèi)星標記。本研究是首次通過抑制PCR的方法構(gòu)建葉螨的微衛(wèi)星富集文庫來開發(fā)微衛(wèi)星，通過此研究，我們得出結(jié)論，葉螨體內(nèi)微衛(wèi)星變異速率較低嚴重的影響了微衛(wèi)星開發(fā)效率。
　　 2)結(jié)合筆者剛開發(fā)的2個微衛(wèi)星及以前報道的6個微衛(wèi)星，對中國18個朱砂葉螨種群和7個二斑葉螨種群，共計1055個葉螨樣本進行了種群遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)分析。8個微衛(wèi)星位

5、點共檢測到109個等位基因。平均每個位點13.63個等位基因。然而，平均每個種群每個位點等位基因豐富度和雜合度都較低，表明我國的葉螨種群遺傳多樣性較差。對朱砂葉螨和二斑葉螨的等位基因豐富度和預期雜合度的T測驗發(fā)現(xiàn):我國的二斑葉螨的多樣性顯著低于朱砂葉螨，這可能是由于朱砂葉螨是本地種，而二斑葉螨是入侵種，在入侵過程中發(fā)生瓶頸效應造成的。通過等位基因豐富度和預期雜合度（AR和HE）與地理坐標（經(jīng)度和緯度）之間的皮爾遜相關性分析表明，朱砂葉螨

6、的遺傳多樣性與緯度成正相關性，這是由于低緯度地區(qū)的朱砂葉螨每年發(fā)生的代數(shù)較多，維持了較高的遺傳多樣性。Hardy-Weinberg平衡測試顯示25個種群里面有23個種群因為雜合體缺失而偏離了平衡，進一步分析發(fā)現(xiàn)無效等位基因的存在是引起偏離平衡的重要因素。
　　 3)25個葉螨種群的總體分化指數(shù)FST為0.506，種群之間高度遺傳分化。種群間基因流較小，種群多樣性較差及存在地理隔離效應是引起朱砂葉螨種群分化的重要因素。通過構(gòu)建NJ

7、系統(tǒng)發(fā)育樹、貝葉斯聚類及分子變異模型分析(AMOVA)，結(jié)果顯示我國的葉螨種群分為五個分支，其中朱砂葉螨的聚類結(jié)果與地理分布有很好的相關性。此外，我們的遺傳數(shù)據(jù)不支持將兩種形式的葉螨分成兩個物種，因為兩者的分化水平處于不同地理種群的分化水平，兩者在DNA組成上沒有實質(zhì)的不同，體色的差異可能由于表觀遺傳方式的不同造成的。
　　 灰飛虱Laodelphax striatellus(Fallén)屬半翅目飛虱科，世界范圍內(nèi)主要分布在溫

8、帶地區(qū)，廣泛分布于東亞、東南亞、歐洲和北非等地，可在溫帶地區(qū)安全越冬。國內(nèi)分布遍及全國各地，以長江流域和華北稻區(qū)發(fā)生較多?；绎w虱除以成蟲、若蟲刺吸危害外，還是多種植物病毒病害的重要媒介昆蟲，可傳播多種病毒病害，其傳毒危害造成的損失遠遠大于其刺吸危害。盡管灰飛虱的經(jīng)濟地位重要，但是對于灰飛虱的種群遺傳學的研究報道卻比較少。原因在于灰飛虱上可用的遺傳標記較少，且不能提供足夠的遺傳學信息。而微衛(wèi)星(microsatellite)分子標記由于廣

9、泛地在基因組中分布、良好的重復性和保真性、較高的變異頻率、呈孟德爾式遺傳、共顯性等優(yōu)點，已成為種群遺傳學研究中應用最為廣泛的分子標記。但是，目前尚未有灰飛虱微衛(wèi)星的開發(fā)的報道。基于以上原因，筆者分別通過褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫和抑制PCR構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫來開發(fā)灰飛虱的微衛(wèi)星，并應用新開發(fā)的9個微衛(wèi)星標記和一段線粒體COI基因的序列對中國17個地理種群共計720個灰飛虱個體展開種群遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究，并得到相關的結(jié)果與結(jié)論:

10、>　　 1)由于國際無灰飛虱微衛(wèi)星的報道，基于EST微衛(wèi)星具有較高的不同種屬之間的轉(zhuǎn)移性、開發(fā)成本低和效率高的特性，首先根據(jù)褐飛虱的EST數(shù)據(jù)庫開發(fā)褐飛虱的微衛(wèi)星，然后驗證在其灰飛虱上的轉(zhuǎn)移性。筆者通過搜索褐飛虱的EST數(shù)據(jù)庫，設計引物并PCR驗證，最終開發(fā)了12個多態(tài)性較好的褐飛虱微衛(wèi)星標記。微衛(wèi)星等位基因的測序結(jié)果揭示了微衛(wèi)星復雜的變異機制。對這12對微衛(wèi)星引物在灰飛虱上面的轉(zhuǎn)移性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):這12對衛(wèi)星引物高度專屬于褐飛虱，不

11、能夠用于灰飛虱。我們得出結(jié)論:灰飛虱與褐飛虱屬于不同的屬，分化時間較長，且進化速度較快，兩者的基因組信息差異太大，導致兩者之間的微衛(wèi)星不能相互轉(zhuǎn)移。
　　 2)通過抑制PCR的方法構(gòu)建了灰飛虱(TC)6(AC)5和(AG)6(AC)5的復合型微衛(wèi)星富集文庫，挑取200個陽性克隆測序，設計了100對微衛(wèi)星引物，最終成功開發(fā)了9個多態(tài)性較好的微衛(wèi)星，通過三個地理種群對新開發(fā)的微衛(wèi)星進行檢測，結(jié)果顯示每個位點具有13到30個等位基因。

12、平均表觀雜合度和預期雜合度分別在在0.255～0.833和0.392～0.929之間，這9個微衛(wèi)星位點具有高度的多態(tài)性，新開發(fā)的微衛(wèi)星位點將為灰飛虱種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究提供有效的分子標記手段，本研究首次在國際上報道了9個灰飛虱微衛(wèi)星，填補了國際無灰飛虱微衛(wèi)星的空白。
　　 3)運用9個微衛(wèi)星分子標記對17個地理種群的灰飛虱種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究，結(jié)果顯示每個種群平均每個位點的等位基因個數(shù)在12.111～16.333之間。所有種群的表觀

13、雜合度介于0.536～0.683之間，預期雜合度介于0.742～0.840之間。說明我國的灰飛虱具有較高水平的遺傳多樣性，并且華東種群和華北種群較東北種群和華南種群的多樣性要高。由于灰飛虱的近交導致大部分種群因雜合體缺失而偏離Hardy-Weinberg平衡。除了華南的永福和南寧種群外，其他種群都具有私有等位基因，這可能是由于華南地區(qū)的分析樣本較少造成的?；贔ST統(tǒng)計顯示種群間分化較小或無分化，總體FST為0.004，只有東北的黑龍江

14、HLJ種群和遼寧的丹東DD種群與其他種群有較微弱的顯著分化，貝葉斯聚類及NJ分析結(jié)果同樣顯示17個種群具有不穩(wěn)定的種群遺傳結(jié)構(gòu)黑龍江HLJ種群和遼寧的丹東DD種群與其他種群有較微弱的差異。AMOVA分析結(jié)果表明灰飛虱的微弱變異主要來自個體之間的差異，而種群間及4個區(qū)域間的遺傳分化極小。與地理距離的相關性分析結(jié)果表明，盡管灰飛虱的遺傳分化水平較低，但是與地理距離還有較弱的負相關性，說明地理距離在灰飛虱種群分化中起一定作用。
　　

15、4)基于線粒體一段COI基因序列對種群的研究發(fā)現(xiàn)，COI基因經(jīng)比對并去掉引物及測序較差的部分后，最終得到了769bp的片段，沒有終止密碼子堿基的插入或缺失出現(xiàn)，共有33個變異位點，占總序列的4.2％，其中簡約信息位點15個?？傮w來說灰飛虱多樣性較好，在720個個體中共發(fā)現(xiàn)了37個單倍型，單倍型多樣性指數(shù)0.159～0.764之間，平均0.642;核酸多樣性較差，在0.101％～0.320％之間，平均0.217％。與微衛(wèi)星的結(jié)果相似，華東

16、種群較東北種群和華南種群的多樣性要高;東北地區(qū)的灰飛虱多樣性較差，平均每個種群有5.5個單倍型，并且這四個種群中無私有單倍型存在。其中最差的是黑龍江HLJ種群，只有3個單倍型。COI基因的FST統(tǒng)計比微衛(wèi)星的結(jié)果稍大，但還是處于較低分化的水平，平均分化指數(shù)為0.055，表明灰飛虱的確分化較小或無分化。COI的分析同樣表明東北的黑龍江種群與其他種群有顯著分化。AMOVA分析結(jié)果同樣顯示灰飛虱的微弱變異主要來自個體之間的差異。
　　

17、 5)根據(jù)微衛(wèi)星和COI基因?qū)绎w虱種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究，我們得出結(jié)論:灰飛虱種群分化水平較低，分化程度與具有遷飛習性的東亞飛蝗相似，種群間基因流較強，灰飛虱可能具有遠距離遷飛習性。基于COI基因的分析發(fā)現(xiàn)37個單倍型在各個種群中分布不均勻，這可能是由于環(huán)境選擇壓力的不同造成，單倍型與灰飛虱的適合度及遷飛是否有某種聯(lián)系需要進一步的實驗驗證，另外，我們還發(fā)現(xiàn)灰飛虱感染的Wolbachia沒有引起單倍型多樣性的降低，但導致了核酸多樣性的降低，