1、小麥籽粒硬度是小麥的最重要的目標性狀之一,它直接決定小麥的磨粉品質和烘烤品質,是小麥品質優(yōu)劣的重要指標。在控制籽粒硬度Ha位點的三個基因中,Puroindoline(Pina)和Puroindoline(Pinb)是主效基因,編碼相對分子量13kDa的強堿性蛋白——PINA和PINB蛋白。這兩種PIN蛋白同時存在于小麥胚乳和糊粉層細胞中,并結合在胚乳淀粉粒的表面,大量存在于成熟種子中。PIN蛋白還能夠有效抑制許多植物病原菌的生長,對革蘭

2、氏陰性菌,革蘭氏陽性菌以及真菌具有明顯的抗性,并且PINA蛋白的抗菌作用強于PINB蛋白。
　　細菌對抗抗生素的途徑主要是通過表達特定的抗性基因分解抗生素,PIN蛋白則主要通過破壞特定脂質成分的病原菌質膜發(fā)揮抗菌能力,因此植物抗菌蛋白有望解決病原菌抗藥性問題,具有很好的發(fā)展?jié)摿Α?br>　　成熟的PIN蛋白具有四個α-螺旋為主的二級結構,五對二硫鍵把整個分子結構聚合成緊密的球型。前兩個α-螺旋之間存在一個含多個疏水Trp殘基和堿性

3、Lys、Asp殘基的色氨酸結構域(TRD),很多證據證明TRD與其控制籽粒硬度和抗菌功能緊密相關。
　　本研究構建了含多個色氨酸結構域的Pina基因人工突變體ABBC和ABBBC,以期獲得抗菌性更強的植物蛋白,同時探索PIN蛋白決定籽粒硬度的分子機理;通過二級結構和三級結構的預測,探索和推測PINA兩個突變蛋白的分子結構。
　　利用PCR技術,成功地擴增了小麥Pina基因并構建了其含有不同色氨酸結構域(TRD)的人工突變體A

4、BBC和ABBBC,并將其整合到到原核表達載體pET43.1a中,實現了在原核表達菌株Rosetta-gami(DE3)中的高效可溶性表達。采用Ni-NTA親和層析技術,獲得了高純度和高濃度的PINA、ABBC和ABBBC重組蛋白。通過最低抑菌濃度的測定和熒光顯微鏡計數評估了重組蛋白的抗菌性變化。結果表明ABBC重組蛋白的抗菌性均明顯高于PINA重組蛋白(P<0.05),其可能成為有潛在的高效抗菌蛋白。而ABBBC重組蛋白的抗菌性均低于

5、PINA重組蛋白,無明顯的應用價值。這一結果表明,通過增加TRD的方式可以提高PINA蛋白抗菌性,但是當TRD數量達到3個拷貝時,抗菌性能反而下降。
　　成功將Pina/ABBC/ABBBC構建到真核表達載體pLRPT中,通過金粉包裹,基因槍轟擊,轉化入四倍體小麥Ofanto中,經過誘導培養(yǎng),分化培養(yǎng),篩選培養(yǎng),春化培養(yǎng)和盆栽培養(yǎng),獲得轉基因后代。使用PCR檢測,SouthernBlot檢測,SDS-PAGE檢測以及Western