1、大豆疫霉(Phytophthora sojae)是一種重要的植物病原菌，所引起的大豆根腐病，每年給世界各大豆主產區(qū)造成高達數百億美元的經濟損失。所以有效地控制大豆疫霉病的發(fā)生和擴展成為研究者的主要任務。然而，由于疫霉菌隸屬于茸鞭生物界卵菌門，在進化上與真菌相差很遠，進化上的差異也使疫霉菌擁有一套與其他真菌不同的致病機制，多數殺菌劑對植物疫病無效。疫霉菌遺傳轉化困難，對疫霉菌與植物互作機理的研究進展緩慢。近年，隨著大豆疫霉全基因組測序的完

2、成和遺傳轉化系統(tǒng)的逐步建立，大豆疫霉菌已經成為研究卵菌分子遺傳的模式種，同時也為從基因水平上理解疫霉菌致病分子機制提供了一個新的平臺。本研究充分發(fā)揮生物信息學技術優(yōu)勢，通過對致病相關MAP kinase PsSAK1沉默突變體DGE表達譜進行分析，迅速篩選到一批受PsSAK1調控的候選基因，結合大豆疫霉的穩(wěn)定轉化和生物學研究手段，確定了PsMYB1轉錄因子的功能以及和PsSAK1的關系，為進一步認識大豆疫病的分子致病機理和開發(fā)該病害的防

3、治措施提供了理論和實踐意義。
　　 研究大豆疫霉的生長發(fā)育及致病過程中的相關基因對解釋病害發(fā)生流行和病害控制有重要理論與實踐價值。在前期工作中，我們借助PEG介導的原生質體轉化方法，確定了2個MAPKs在大豆疫霉生長發(fā)育及致病過程中的重要作用。我們試圖進一步探求其作用機制，而研究MAPK途徑的關鍵是找到它的下游調控基因。因此，我們利用DGE表達譜分析技術對大豆疫霉PsSAK1、PsMPK1沉默突變體不同階段進行轉錄組分析，結果發(fā)

4、現，應答外界刺激的MAPK PsSAK1的沉默，導致轉錄因子、蛋白激酶、結構蛋白以及致病相關因子編碼基因表達水平發(fā)生顯著變化。其中轉錄因子的轉錄水平變化明顯。另外，負責調控細胞壁完整性途徑的PsMPK1的功能缺失，導致細胞壁相關蛋白編碼基因、PsNLP1的基因表達水平顯著變化。結合我們的表型結果顯示突變體的游動孢子在與寄主植物互作過程中，誘導寄主細胞死亡，阻止病原菌的擴展，我們推測，PsMPK1的功能缺失，造成細胞壁受損，導致在與寄主互

5、作過程中重要致病因子外漏，誘導寄主壞死反應，是沉默突變體致病力喪失的重要成因。
　　 在PsSAK1沉默突變體DGE表達譜顯著下調的轉錄因子編碼基因中，我們鑒定了一個R2R3型MYB轉錄因子編碼基因-PsMYB1，該基因全長1542bp，含有3個內含子，其編碼的蛋白含513個氨基酸。qRT-PCR的結果顯示PsMYB1的轉錄水平在孢子囊形成階段，休止孢萌發(fā)，以及侵染早期上調表達，而在游動孢子階段幾乎消失。PsMYB1的沉默突變體

6、菌絲生長速率以及有性生殖無差別;然而，在孢子囊的發(fā)育，游動孢子的正常形成以及成功釋放，侵染寄主大豆等方面表現出嚴重的功能缺失。該基因的沉默導致＞50％的孢子囊不能正常釋放游動孢子，轉而直接萌發(fā)，這直接造成游動孢子的產量極顯著的下降。而且，游動孢子表現出休止提前，萌發(fā)率降低，接種大豆黃化苗下胚軸后致病力下降。究其原因，我們發(fā)現，PsMYB1的功能缺失導致部分孢子囊內原生質體不能正常割裂，細胞核排布異常。結合PsSAK1的沉默突變體在以上各

7、個階段的表現型，闡明了受PsSAK1調控的PsMYB1負責調控大豆疫霉包括孢子囊細胞質的割裂，細胞核的排布，以及游動孢子釋放及萌發(fā)等一系列致病相關生物學過程。
　　 對已克隆的PsMYB1的同源物的研究發(fā)現大豆疫霉可能具有龐大的MYB基因家族。通過對大豆疫霉基因組數據庫、真菌轉錄因子數據庫(FTFD)，蛋白功能域結構分析軟件(SMART)的生物信息學注釋，結合手動修正基因模型，我們預測到大豆疫霉中含有68個MYB轉錄因子。其中包

8、含47個R1型(PsMYB-like1-1～PsMYB-like1-47)，9個R2R3型(PsMYB-like2-1～ PsMYB-like2-9)，10個R1R2R3型(PsMYB-like3-1～PsMYB-like3-10)，還有2個蛋白分別含有4或5個Myb功能域(PsMYB-like4-1，PsMYB-like5-1)。利用DGE表達譜分析技術對這68個MYB基因在大豆疫霉菌5個不同無性發(fā)育階段及5個侵染階段的高通量表達分析

9、，發(fā)現所有基因的表達量至少在一個階段能被檢測到。同時，我們對相同轉錄模式的基因進行歸類，共分為7類。并結合68個Myb家族候選成員在兩個MAPKs的沉默突變體，三個DGE表達譜中的各自差異表達水平，分析其在大豆疫霉致病相關生物學過程中扮演的角色。
　　 鑒于PsMYB1在大豆疫霉菌生長發(fā)育以及致病相關生物學過程中的重要作用，我們假設MYB基因家族中的其他同族基因在致病過程中同樣扮演重要角色。為了驗證這一假說，我們結合大豆疫霉5個

10、無性發(fā)育階段和5個侵染階段的轉錄量分析，沉默突變體的DGE表達譜分析，以及雙鏈RNA(dsRNA)介導的基因沉默對MYB家族候選基因進行高通量篩選。我們鑒定了在侵染階段上調表達的4個基因分別是:PsMYB-like2-2(Ps127211), PsMYB-like1-7(Ps131312), PsMYB-like1-39(Ps141522),PsMYB-like3-6(Ps133941)。而在三個突變體不同階段的DGE轉錄譜中，4個基因

11、均表現出在某一階段由于MAPK的沉默導致發(fā)生顯著的基因水平的變化。其中，我們發(fā)現了一個R1型Myb轉錄因子PsMYB-like1-39(Ps141522)，與游動孢子的釋放過程密切相關，但不影響大豆疫霉的致病力。
　　 本文從致病相關MAPK PsSAK1的功能缺失突變體轉錄組數據入手，尋找由于該基因的沉默而導致轉錄量下降的候選基因，從中成功鑒定了PsMYB1轉錄因子在大豆疫霉致病相關發(fā)育階段的作用。根據這一重要線索，結合生物信