1、家蠶是由野蠶馴化而來的泌絲昆蟲，具有很高經(jīng)濟價值，然而我國每年卻因蠶病造成近百億左右的損失，嚴重影響到產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。研究表明，當微生物感染昆蟲時，能誘導其產(chǎn)生不同的抗微生物肽以殺死入侵微生物。而這些抗微生物肽基因的表達主要通過Toll和Imd(immunedeficiency)信號途徑調控。我們通過對家蠶免疫相關基因中的短型肽聚糖識別蛋白3(BmPGRP-S3)和β-葡聚糖識別蛋白3、4(BmβGRP3、4)及Toll、Imd途徑關

2、鍵基因BmSpz1和BmImd的研究，初步探索家蠶體液免疫的模式識別、信號傳導和抗微生物肽基因表達調控機制。獲得主要結果如下：
　　 1.模式識別受體編碼基因的克隆及表達譜分析
　　 模式識別受體在體液免疫-Toll和Imd途徑中行使模式識別功能，并調控激活下游信號因子和抗微生物肽基因的表達。我們對家蠶模式識別受體-肽聚糖識別蛋白(PGRPs)和β-葡聚糖識別蛋白(βGRPs)家族基因進行研究，克隆得到10個PGRPs和

3、4個βGRPs，得到BmβGRP3、BmPGRP-S3、-S4和BmPGRP-L5的完整編碼序列。βGRPs家族成員都具有信號肽，其中BmβGRP1-3成簇分布于11號染色體，且不具有典型的葡聚糖結合結構域，BmβGRP4獨立分布于22號染色體，具有典型的葡聚糖結合結構域。PGRPs的長型和短型亞家族都具有典型的酰胺酶活性(amidaseactivity)結構域，短型亞家族具有信號肽，長型亞家族則不具有。5個長型亞家族基因成簇分布于1號

4、染色體，5個短型亞家族基因中有2個分布于9號染色體和3個分布于16號染色體。人工飼料無菌飼育的大造品系5齡3天幼蟲添食大腸桿菌(E.coli，Ec)、家蠶黑胸敗血菌(B.bombysepticus，Bs)和家蠶白僵菌(B.bassiana，Bb)，免疫誘導3、6、12和24h四個時間點的個體水平熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)PGRPs長型亞家族基因BmPGRP-L1、-L3和短型亞家族基因BmPGRP-S1-3均能被革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌

5、和真菌誘導上調表達；βGRPs基因家族中的BmβGRP3、4也能被上述三種微生物誘導上調表達。組織表達譜分析表明，所檢測的13個識別受體基因，在頭部組織中，BmβGRP2，4、BmPGRP-L2和BmPGRP-S1，-S3-5均能被陰性菌、陽性菌和真菌誘導上調表達；在表皮、中腸和脂肪體中，只有少數(shù)識別受體基因被三類微生物誘導上調表達。
　　 2.BmβGRP3功能研究
　　 果蠅(Drosophila)基因組中有編碼3個

6、陰性菌結合蛋白的基因，其中GNBP1由Lys-PGN激活，GNBP3由真菌激活，GNBP1和GNBP3均在Toll信號途徑上游起模式識別功能并調控該信號通路。家蠶BmβGRP1、2被證實具有結合β-1，3-葡聚糖的能力且激活家蠶細胞免疫應答，但并未發(fā)現(xiàn)它們具有在家蠶Toll或Imd信號途徑上游行使模式識別的功能。
　　 BmβGRP3的開放式閱讀框(openreadingframe，ORF)為1470bp，編碼489個氨基酸，N

7、-端有一個由17個氨基酸組成的信號肽，推測可能為分泌型蛋白，48和454位處的天冬氨酸是潛在的糖基化位點，蛋白分子量為53kDa，等電點6.25。BmβGRP3的氨基酸序列高度保留了結合β-1，3-葡聚糖的功能結構域，該結構域能結合三重螺旋結構的β-1，3-葡聚糖。家蠶BmβGRP3在個體水平能被革蘭氏陰性菌、陽性菌和真菌誘導上調表達，其中在個體水平陽性菌和真菌誘導上調表達能力強于陰性菌。組織水平上，在表皮中能被真菌高量誘導上調表達，陽

8、性菌對該基因基本無誘導表達能力；在脂肪體中能被陰性菌高量誘導上調表達，陽性菌和真菌誘導上調表達該基因的能力較弱；在中腸組織中，該基因能被陰性菌和陽性菌較明顯地誘導上調表達，真菌對該基因基本無誘導表達能力，表明家蠶BmβGRP3在應對不同微生物誘導時有著不同的表達模式和組織特異性。RNA干涉抑制BmβGRP3表達相關研究表明其在家蠶Toll信號途徑上游行使模式識別功能和激活調控該途徑的作用；進一步研究發(fā)現(xiàn)BmβGRP3的抑制表達會降低To

9、ll信號途徑的信號因子BmSpz1等基因的表達和抗微生物肽基因BmCecropin-A1、BmCecropin-E、BmAtt2和BmEnb1的表達，表明Toll信號途徑可能調控抗微生物肽基因BmCecropin-A1、BmCecropin-E、BmAtt2和BmEnbl的表達。另一方面，家蠶BmβGRP3的抑制表達不會影響到Imd信號途徑信號因子BmImd和抗微生物肽基因BmCecropin-B、BmCecropin-D和glover

10、in2的表達，暗示其它免疫調控途徑如Imd信號途徑可能調控抗微生物肽基因BmCecropin-B、BmCecropin-D和gloverin2表達。
　　 對家蠶Toll和Imd信號途徑免疫因子BmSpz1、BmImd等基因的誘導表達分析結果表明三類微生物(革蘭氏陰性菌、陽性菌和真菌)都能激活家蠶的Toll和Imd信號途徑，這與模式生物果蠅的Toll和Imd信號途徑有很大的不同。果蠅的Toll信號途徑只能被擁有DAP-型肽聚糖的

11、細菌和真菌免疫激活，其Imd信號途徑能被革蘭氏陰性菌和部分陽性菌免疫激活。推測家蠶在其長期的進化過程中獲得了更有效的免疫應答機制。
　　 3.BmβGRP4和BmPGRP-S3的原核表達和功能研究
　　 本研究已初步證實BmβGRP3位于Toll信號途徑上游并可能調控抗微生物肽基因BmCecropin-A1、BmCecropin-E、BmAtt2和BmEnb1的表達。然而關于Imd信號途徑的免疫激活和抗微生物肽的表達調控

12、仍有待進一步研究。
　　 我們期望通過對BmβGRP4和BmPGRP-S3進行研究，以闡明模式識別受體在家蠶體液免疫應答中的具體生物學功能。構建了BmβGRP4和BmPGRP-S3的原核表達載體，純化得到BmBGRP4和BmPGRP-S3蛋白，并制備了多克隆抗體。革蘭氏陰性菌、陽性菌和真菌免疫誘導18h，BmβGRP4和BmPGRP-S3的mRNA表達量和蛋白量都顯著提高。該處理方式提高了Toll信號途徑調控抗微生物肽基因BmE

13、nb1的表達，暗示家蠶Toll和Imd信號途徑可能各自獨立地調控抗微生物肽基因的表達。
　　 4.BmSpz1和BmImd的功能研究
　　 通過對家蠶模式識別受體-BmβGRP3、BmβGRP4和BmPGRP-S3的研究，初步證明了它們在家蠶先天免疫應答反應中的功能。為了進一步驗證家蠶Toll和Imd信號途徑所調控的抗微生物肽基因，我們又分別對家蠶Toll和Imd信號途徑的關鍵基因BmSpz1和BmImd進行研究，希望藉

14、此揭示家蠶Toll和Imd信號途徑免疫信號的傳導機制和抗微生物肽基因的表達調控模式。
　　 通過對BmSpz1和BmImd研究再次證實了家蠶Toll和Imd信號途徑均能被三類微生物(革蘭氏陰性菌、陽性菌和真菌)誘導激活；Toll信號途徑可能調控抗微生物肽基因BmCecropin-A1、BmCecropin-E、BmAtt2和BmEnb1的表達；Imd信號途徑可能調控家蠶抗微生物肽基因BmCecropin-B、BmCecropin

15、-D、BmMoricin和Bmgloverin1、2的表達。
　　 5.家蠶抗微生物肽基因表達調控機制
　　 昆蟲抗微生物肽是昆蟲在抵抗微生物侵染過程中合成的一類小分子多肽，在昆蟲先天免疫中起重要作用。家蠶基因組中含有比其它昆蟲基因組更多的抗微生物肽基因，它們大多數(shù)以多基因家族的形式存在，具有協(xié)同表達特點。另外家蠶的抗微生物肽基因還含有多個CAATW元件，可能對基因轉錄的起始頻率起調節(jié)作用，同時家蠶抗微生物肽還具有很高的

16、可誘導性和較好的抗微生物活性。到目前為止，我們仍不清楚家蠶抗微生物肽基因的表達調控機制，通過本文的研究，我們提出了一個可能的家蠶抗微生物肽基因表達調控模式。
　　 綜上所述，首先，Toll信號途徑由其上游的模式識別受體BmβGRP3完成對入侵微生物的識別并順序激活該途徑的信號因子，如胞外的BmSpz1、跨膜的Toll受體和胞內的BmMyd88、BmTube等，致使BmRel由核外進入核內，結合家蠶抗微生物肽基因的表達調控區(qū)域(κ

17、B-like和GATA元件等)，從而完成對家蠶抗微生物肽基因BmCecropin-A1、BmCecropin-E、BmAtt2和BmEnb1的表達調控。其次，Imd信號途徑由其上游的模式識別受體BmβGRP4和BmPGRP-S3完成對入侵微生物的識別并順序激活該途徑的信號因子，致使BmRelish由核外進入核內，結合家蠶抗微生物肽基因的表達調控區(qū)域(κB-like和GATA元件等)，從而完成對家蠶抗微生物肽基因BmCecropin-B、