1、布魯氏菌?。˙rucellosis)是由布魯氏菌引起的一種廣泛流行、人畜共患的慢性傳染病，不僅給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重危害著人們的健康。目前，疫苗接種是預(yù)防該病的主要手段。我國(guó)自主研制的M5-90疫苗株對(duì)預(yù)防綿羊和山羊布魯氏菌病起到了積極的作用，但由于無(wú)法區(qū)別自然感染和疫苗免疫，給布病的臨床血清學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查等造成了障礙，加之該疫苗毒力強(qiáng)、容易引起懷孕母畜的流產(chǎn)等缺點(diǎn)，使得該疫苗的應(yīng)用受到很大限制。為此，本研究開(kāi)發(fā)了一種

2、有效區(qū)分自然感染和疫苗免疫的布魯氏菌弱毒基因缺失疫苗，為布魯氏菌病的防控提供技術(shù)支持。
　　 以熱滅活的布魯氏菌M5-90為模板，分別擴(kuò)增WboA基因和 pgm基因的上下游同源臂序列，以枯草桿菌和pEGFP-N1質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增SacB基因和gfp基因，將擴(kuò)增序列連接于pMD18-T simple載體，雙酶切后將上下游同源臂序列和gfp基因連接至自殺載體pGEM-7Zf+上，分別得到pGEM-7zf-ΔWboA和pGEM-7

3、zf-Δpgm-gfp，再將SacB基因單酶切后分別連接至以上兩個(gè)載體中，電轉(zhuǎn)化布魯氏菌M5-90感受態(tài)細(xì)胞，篩選ΔWboA和 Δpgm基因缺失株，以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行缺失株的毒力評(píng)價(jià)；分別用3.0×106 CFU劑量的ΔWboA、Δpgm和M5-90疫苗株接種BALB/c小鼠，用ELISA方法檢測(cè)小鼠外周血血清中抗體IgG及細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ的含量；用流式細(xì)胞儀對(duì)小鼠外周血中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析，并對(duì)免疫3

4、0天后的小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)性；根據(jù)GenBank中發(fā)表的羊種布魯氏菌16M的WboA基因和pgm基因序列設(shè)計(jì)引物，用PCR方法擴(kuò)增M5-90的WboA基因和pgm基因的編碼序列，克隆到原核表達(dá)載體pET-28a，導(dǎo)入大腸桿菌DE3誘導(dǎo)表達(dá)，將獲得的目標(biāo)蛋白用 Ni-NTA Agarose試劑盒進(jìn)行純化，并進(jìn)行Western blot分析；將純化的WboA蛋白和pgm蛋白作為抗原，用M5-90、ΔWboA和Δpgm疫苗免疫的小

5、鼠血清作為一抗進(jìn)行Western blot分析，檢測(cè)ΔWboA和Δpgm疫苗免疫的小鼠血清中是否存在抗WboA蛋白和pgm蛋白的抗體。用虎紅平板凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)檢測(cè)免疫小鼠的抗體水平。
　　 成功構(gòu)建并篩選了遺傳穩(wěn)定的布魯氏菌疫苗株M5-90 ΔWboA缺失株和Δpgm缺失株，15代內(nèi)未發(fā)生回復(fù)突變。布魯氏菌M5-90ΔWboA基因缺失株比親本株M5-90的毒力明顯減弱且免疫保護(hù)性略低于親本株，Δpgm基因缺失株與親本株的