1、我國每年僅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中形成的農(nóng)作物殘渣(麥秸、玉米秸稈)等就約6億t,其富含木質纖維素。應用食用菌轉化秸稈、變廢為寶是一條成功的途徑。為提高食用菌利用木質纖維素的能力,提高食用菌對秸稈的生物學效率,本文以平菇天達300為材料,構建了高效遺傳表達體系,并進行了漆酶基因轉化。研究結果如下:
　　 (1)平菇sdi啟動子的克隆及表達載體25號的構建和轉化克隆了平菇天達300的同源啟動子-1.3kb的sdi啟動子,利用重疊PCR將sdi啟

2、動子片段和潮霉素抗性基因hph融合,構建了以pMD19-T載體為骨架,含有sdi啟動子和hph以及CaMV終止子的表達載體25號。
　　 以液體培養(yǎng)的平菇菌絲為實驗材料,0.6mol/L甘露醇作滲透壓穩(wěn)定劑,濃度為1.6％的溶壁酶溶液,30℃酶解3h,獲得具有再生活力的原生質體。平菇天達300原生質體的得率約為5.7×106個/mL,在RCM再生平板上的再生率為0.46％。
　　 通過平菇的潮霉素抗性試驗,確定了其菌絲和

3、原生質體的潮霉素致死濃度。據(jù)此將轉化的初篩濃度定為80μg/mL,復篩濃度定為100μg/mL。采用PEG—CaCl2介導原生質體轉化的方法,將表達載體25號轉化入平菇,在含80μg/mL潮霉素RCM平板上,獲得一系列轉化子。這些轉化子經(jīng)過復篩和PCR鑒定后得到潮霉素抗性基因hph整合入宿主基因組的陽性轉化子。將陽性轉化子菌株進行表型和RNA轉錄水平驗證,表明hph基因整合入平菇的基因組,其抗性可以穩(wěn)定的遺傳和表達,從而建立了平菇的遺傳

4、轉化體系。
　　 (2)食用菌不同轉化體系轉化效率的比較將兩個含有潮霉素抗性基因但啟動子不同的真菌表達質粒pAN7-1和PBHt1,導入平菇中與25號做比較表明,不同的啟動子得到的抗性轉化子生長速率、轉化率、RNA水平上的轉錄都不同。pAN7—1抗性轉化子轉化率最高,0.4個轉化子/μg質粒DNA,其hph目的基因的表達量最大；其次是25號抗性質粒,0.2個轉化子/μg質粒DNA；PBHt1的表達量較少。
　　 (3)平

5、菇漆酶基因poxc的克隆和同源表達利用RT-PCR和LAPCR步行等技術從平菇天達300中獲得編碼漆酶基因poxc的gDNA和cDNA。gDNA全長為3818bp,包含19個內(nèi)含子和20個外顯子。cDNM序列全長為1607bp,編碼533個氨基酸的蛋白,與其它真菌漆酶蛋白序列有較高的同源性,并且含有3個真菌類Cu-oxidase的高度保守結構域。
　　 構建了含有sdi啟動子和poxc基因的同源表達載體PIPOXC和PI2POX