1、學校代碼：—102—00分類號：094研究生學號：—1020020—0710226密級：玉東牡JIf予冠大雪博士學位論文應用基因沉默技術調節(jié)大豆脂肪酸代謝進而選育高油和高油酸大豆新材料Regulationoffattyacidmetabolisminseedsofsoybeanwithgenesilencingtogethighoilandhigholeicacidmaterials作者：陳偉指導教師：劉立俠學科專業(yè)：植物學研究方向：植

2、物生物工程東北師范人。Z學位評定委員會2011q6JJ摘要應用基因工程技術調節(jié)大豆脂類代謝途徑，探索相關基因的調控機制，對于大豆脂肪酸合成的基礎研究和品質育種是一項有效和快捷的途徑。本論文以吉林大豆為材料，以蛋白質和脂肪酸代謝的“底物競爭”假說為依據(jù)，采用基因工程技術，探討大豆向刃(脂肪酸脫氫酶)基因和p印c(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)基因在調控大豆種子脂肪酸合成代謝中的作用，進而選育高油酸和高油的轉基因大豆材料。根據(jù)基因沉默原理，克隆了

3、大豆向d2和p唧基因的片段，分別構建了基因沉默ihpIⅢA高效表達載體pBIGFPFAD2、pBIFAD2和pBIPEP；以農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法并結合嫁接技術轉化和篩選大豆吉林35，對再生植株進行分子鑒定，基因功能檢測和一系列生理生化實驗，分析和研究了p印c基因和叩c基因在大豆種子發(fā)育過程中的時間表達模式。通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法將pBIGFPFAD2載體轉化三個高油大豆品種吉林35，吉林47和吉科豆l號。檢測報告基因GFP的表

4、達，結果表明，吉林35是大豆胚尖再生系統(tǒng)中最敏感的品種，其表達效率可達到429％。本實驗優(yōu)化了大豆胚尖轉化系統(tǒng)的卡那霉素篩選壓力，并首次嘗試將嫁接技術應用到大豆再生系統(tǒng)中替代生根煉苗過程，再生苗的成活率從10％提高到80％，煉苗周期由45天縮短到10天。pBIFAD2轉化吉林35共獲得180株再生植株，其中34株PCR陽性植株經(jīng)分子檢測證明外源基因已經(jīng)整合到植物基因組中，8份材料種子油酸含量有不同程度的提高。陽性材料通過Southem和

5、Nonhem雜交檢測、脂肪酸含量及油酸脫氫比例(ODP)分析，證明ihpRNA沉默廊比基因，導致了油酸含量增加、亞油酸含量降低的效果，并且具有孟德爾單因素遺傳規(guī)律。陽性植株種子脂肪酸檢測表明，油酸含量從對照的175％提高到50％左右。通過農(nóng)桿菌介導轉化pBIPEP載體到吉林35大豆中，共獲得再生植株265株，PCR陽性植株64株，Southem雜交證明目的基因整合至基因組中。75％陽性植株(48株)的油含量有不同程度的提高，其中9份陽性