1、朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)是一種為害嚴重而又難以防治的重要農(nóng)業(yè)害螨，在我國分布廣泛，對包括棉花、多種蔬菜在內(nèi)的許多植物都有危害。該螨世代周期短，繁殖力強，近親交配率高，受藥機會多，很容易產(chǎn)生抗藥性。酯酶作為一種水解酶，能夠水解羧酸酯鍵和磷酸酯鍵，代謝多種含有酯鍵的殺蟲劑，是害蟲產(chǎn)生抗性的主要因素之一。
　　 本研究在前人已經(jīng)克隆得到朱砂葉螨酯酶基因TCE1,TCE2的基礎上，建立了適于定量檢測朱

2、砂葉螨mRNA表達的real-time PCR方法，并用該方法檢測了酯酶基因TCE1和TCE2的mRNA分別在朱砂葉螨不同發(fā)育時期(卵、幼螨、若螨和成螨)、不同品系(阿維菌素、甲氰菊酯、氧化樂果抗性品系和敏感品系)以及藥劑(阿維菌素、甲氰菊酯、氧化樂果)誘導前后的表達差異，從基因水平探討了朱砂葉螨酯酶基因的表達變化與其抗藥性形成之間的內(nèi)在聯(lián)系。此外，還成功構建了酯酶TCE1，TCE2基因的重組原核表達載體pET43a-TCE1，pET4

3、3a-TCE2，且在E.coli Transetta中成功進行了蛋白表達。本研究獲得的主要成果如下：
　　 ⑴利用RT-PCR技術，從朱砂葉螨體內(nèi)獲得了七條候選內(nèi)參基因的擴增片段，并提交到GenBank，取得相應的登錄號分別為RPS18(FJ608659)：262bp，5.8SrRNA(FJ526334)：470bp，GAPDH(FJ526335)：293bp，RPL13a(FJ608662)：242bp，TBP(FJ60866

4、1)：365bp，SDHA(FJ608660)：594bp，α-TUB(FJ526336)：962bp。采用實時熒光定量PCR方法并使用geNorm和NormFinder兩個軟件共同篩選最適合朱砂葉螨的內(nèi)參基因。內(nèi)參基因篩選結果為：5.8s rRNA，α-TUB，RPS18，GAPDH，RPL13a,β-actin表達穩(wěn)定度的平均值M在不同品系中依次為0.381，0.449.0.352，0.460，0.445，0.643，表達穩(wěn)定度由高

5、到低排序依次為RPS18＞5.8srRNA＞RPL13a＞0.449＞GAPDH＞β-actin；M值在不同螨態(tài)中依次為0.762，0.555，0.537，0.855，0.574,0.768，表達穩(wěn)定度由高到低排序依次為RPS18＞α-TUB＞RPL13a＞5.8srRNA＞β-actin＞GAPDH。再通過NormFinder軟件計算各內(nèi)參基因的穩(wěn)定度值，最終確定了在不同品系朱砂葉螨中以5.8s rRNA和RPS18兩個看家基因作為內(nèi)

6、參基因最理想，在不同螨態(tài)中以RPS18，α-TUB兩個看家基因作為內(nèi)參基因最理想，并據(jù)此建立了基于SYBR GreenⅠ染料技術的適于朱砂葉螨mRNA表達定量檢測的real-time PCR方法，即實時熒光定量PCR(qrtPCR)。
　　 ⑵采用建立的qrtPCR方法檢測了酯酶基因TCE1和TCE2的mRNA在朱砂葉螨敏感品系的卵、幼螨、若螨和成螨四個螨態(tài)的相對表達。檢測結果表明朱砂葉螨TCE2基因的表達量在各螨態(tài)中均顯著高于

7、TCE1基因(幼螨除外)，而兩條酯酶基因(TCE1和TCE2)mRNA的表達量均在成螨體內(nèi)最高。
　　 ⑶相對于敏感品系，TCE1基因在朱砂葉螨抗性品系(阿維菌素、甲氰菊酯和氧化樂果抗性品系)中的相對表達量為1.06～1.14倍，無顯著性差異；TCE2基因的相對表達量為1.39～2.47倍，均顯著高于在敏感品系中的表達。
　　 ⑷分別用亞致死劑量(LC30)的阿維菌素、氧化樂果和甲氰菊酯對朱砂葉螨敏感品系進行誘導，測定誘

8、導前后酯酶基因TCE1和TCE2 mRNA的相對表達量，結果表明，經(jīng)藥劑處理后，酯酶基因TCE1的表達量在處理后4h顯著下降，而后又上升，但其表達量在測定時間內(nèi)(處理后0-20h)一直沒有超過未施藥的對照。酯酶基因TCE2的表達量隨時間延長呈現(xiàn)先升高再降低的變化趨勢，且與對照相比差異顯著。TCE2基因的相對表達量在受到三種藥劑誘導后的最高表達量分別是對照的1.64-，2.92-和2.24倍。以上研究表明朱砂葉螨酯酶基因TCE2擴增是其對