1、柑橘的周期性凍害在世界范圍內時有發(fā)生,造成了巨大的經濟損失。采用轉基因技術將抗寒基因導入柑橘栽培品種中表達是縮短育種周期,快速獲得柑橘抗寒品種的有效途徑之一。但是目前有關柑橘抗寒基因克隆的研究很少,這種情況嚴重限制了柑橘抗寒分子育種的進展。
　　 本研究從柑橘的抗寒近緣種枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)中克隆出了柑橘冷響應基因表達調控途徑中的3個關鍵基因PtrICE1、PtrHOS1和PtrLOS2,

2、同時對它們進行了詳細的生物信息學分析,研究了它們在不同環(huán)境脅迫下在枳中的時空表達模式。通過轉基因技術鑒定了其中一個編碼上游轉錄因子的基因PtrICE1的功能,證明了在模式植物煙草中超量表達PtrICE1能夠提高轉基因煙草的抗寒性。然后克隆出了PtrICE1的上游啟動子序列,并且通過轉基因技術初步證明該啟動子具有一定的冷響應和機械損傷響應活性。本研究為最終通過轉基因技術獲得抗寒性強的柑橘栽培品種提供了新的基因資源和理論基礎。本研究獲得的主

3、要結果如下:
　　 1.從枳中克隆出了一個bHLH(basic Helix-Loop-Helix)家族基因PtrICE1,該基因長1933 bp,包含一個1464 bp的開放閱讀框(ORF),編碼487個氨基酸,蛋白質分子量為53.6 kDa,等電點為5.30。PtrICE1蛋白與其它植物ICE1家族蛋白的氨基酸序列一致性很高,并且具有保守的SUMO(small ubiquitin-relatedmodifier)結合結構域、b

4、HLH結構域和C-末端區(qū)域。系統(tǒng)進化樹的分析結果表明,植物ICE1家族蛋白可分為雙子葉植物類和單子葉植物類兩大類,PtrICE1屬于雙子葉植物類。
　　 2.在正常的生長條件下,PtrICE1在枳根、莖、葉中都有一定程度的表達。冷處理之后,枳葉和莖中PtrICE1表達先上調后下調,在根中表達先下調后上調。ABA處理之后,枳葉、莖、根中PtrICE1表達都是先上調后下調。這些結果說明冷處理和ABA處理都能影響枳不同器官中PtrIC

5、E1的表達。
　　 3.構建了PtrICE1的超量表達載體pMVICE1,并通過根癌農桿菌介導的葉盤法將pMVICE1導入模式植物煙草中,使PtrICE1在煙草中超量表達。通過PCR檢測獲得了17個陽性T0代轉基因煙草植株。T0代轉基因煙草的生長速度比野生型煙草慢,開花時間比野生型煙草推遲10 d左右,開花以后兩者的表型差異不大。
　　 4.T0代轉基因煙草果實成熟后收集種子,經Km抗性篩選后獲得陽性T1代轉基因煙草。通

6、過比較T1代轉基因和野生型煙草在冷處理后的相對電導率、成活率以及表型后發(fā)現(xiàn),與野生型煙草相比,T1代轉基因煙草的相對電導率更低,成活率更高,并且常溫處理之后能夠恢復生長,說明轉基因煙草的抗寒性比野生型更強,因此我們認為在植物中超量表達PtrICE1能夠提高植物的抗寒性。
　　 5.本研究克隆出了PtrICE1基因的DNA序列。通過比較PtrICE1編碼區(qū)的DNA和cDNA序列發(fā)現(xiàn),PtrICE1含有四個外顯子和三個內含子。采用p

7、MD18-T載體介導的接頭PCR方法克隆了PtrICE1基因的上游啟動子序列,并采用PLACE程序對PtrICE1啟動子上可能存在的順式作用元件進行了分析,結果找到一些與植物抗逆性相關的順式作用元件,其中包括冷響應元件(CRT/DRE、MYC)、光響應元件(GT1、GATA)、脫水和ABA響應元件(ABRE、MYB)和各種激素響應元件(ARF、ASF、GARE、WBOX等)。
　　 6.本研究構建了能夠檢測PtrICE1啟動子活

8、性的表達載體pBIPROICE1:GUS。通過根癌農桿菌介導的葉盤法將pBIPROICE1:GUS導入模式植物煙草中,并通過PCR檢測獲得了陽性的T0代轉基因煙草。T0代轉基因煙草葉片的GUS組織化學染色結果表明,野生型煙草葉片未出現(xiàn)藍色斑點,而未經冷處理時轉基因煙草葉片表面只出現(xiàn)了少量的藍色斑點,但在葉片切口處染色較深。4℃冷處理之后,轉基因煙草葉片上藍色斑點的數(shù)量增加,且在葉片傷口處染色較深,說明PtrICE1啟動子具有冷響應和機械

9、損傷響應活性。
　　 7.從枳中克隆出了PtrHOS1基因,該基因長3434bp,包含一個2922 bp的開放閱讀框,編碼974個氨基酸,蛋白質分子量為110.2 kDa,等電點為5.55。PtrHOS1蛋白與其它植物HOS1類似蛋白的氨基酸序列一致性很高,并且在PtrHOS1蛋白的N末端含有一個高度保守的環(huán)指結構域(RING finger domain)。植物HOS1類似蛋白可分為雙子葉植物類和單子葉植物類兩大類,PtrHOS

10、1屬于雙子葉植物類。在正常的生長條件下,PtrHOS1在枳根、莖、葉中表達強烈,冷處理和ABA處理之后,在枳的根、莖、葉中PtrHOS1的表達都出現(xiàn)了暫時的下調,說明在枳的根、莖、葉中PtrHOS1的表達都受冷處理和ABA處理的下調調控。
　　 8.從枳中克隆出了PtrLOS2基因,該基因長1662 bp,包含一個1338 bp的開放閱讀框,編碼445個氨基酸,蛋白質分子量為47.79 kDa,等電點為5.54。PtrLOS2蛋

11、白與擬南芥LOS2蛋白及其它植物烯醇酶的氨基酸序列一致性很高(超過86％),說明PtrLOS2很可能編碼一種烯醇酶。PtrLOS2含有兩個高度保守的結構域,它們分別是DNA結合結構域和轉錄抑制結構域。在正常的生長條件下,PtrLOS2在枳根、莖、葉中都有表達,枳根和莖中PtrLOS2的表達量要高于葉中。從總體上來說,經過冷處理后,枳葉片和莖中PtrLOS2的表達是先上調后下調,而在根中PtrLOS2的表達是下調的。ABA處理之后,枳葉片