1、隨著生活水平的不斷提高,人們對畜產品特別是豬肉產品的品質要求越來越高,如何降低脂肪沉積改善肉產品品質已成為困擾養(yǎng)殖業(yè)的新問題。大量的研究證實,通過添加植物提取物等可有效的改變畜體脂肪酸組成,抑制腹脂沉積,改善肉的風味。人和實驗動物的研究結果表明,大豆中普遍存在的異黃酮類植物雌激素在降低血脂、抑制脂肪沉積等方面有積極的作用,且無明顯的毒副作用,在調節(jié)體脂組成,改善胴體品質等方面有廣闊的應用前景。大豆苷是大豆中存在的一種主要的異黃酮類植物雌

2、激素,可在動物腸道內糖苷酶的作用下降解為有活性的大豆苷元,后者可在特異性腸道微生物的作用下代謝為具有更高生物活性的雌馬酚,它們與內源雌激素均具有相似的結構,在體內發(fā)揮類雌激素作用。本文旨在通過在無豆日糧基礎上單獨灌胃大豆苷元、雌馬酚或將大豆苷元及雌馬酚產生菌共同灌胃的方式研究其對模型動物SD大鼠生長性能、血液及肝臟脂質含量變化、肝臟脂代謝相關酶活的影響,以闡明引入外源的雌馬酚產生菌能否提高大豆苷元對機體脂質水平及脂代謝調節(jié)的影響,并通過

3、體外細胞培養(yǎng)對其調控機制及雌激素受體依賴性進行進一步探討,以期為大豆苷元及其降解菌在畜產品脂代謝調控中的應用提供理論依據。本試驗分為三部分:
　　 試驗一:大豆苷元及其降解產物雌馬酚對SD大鼠脂代謝的影響
　　 本試驗在雌性大鼠采食無豆日糧的基礎上,通過單獨灌胃適量的大豆苷元、雌馬酚及共同灌胃大豆苷元和雌馬酚產生菌ZX-7,研究其對SD大鼠生長性能、血脂變化、肝臟脂質含量及脂代謝相關酶活的影響,以闡明引入外源的雌馬酚產生

4、菌能否提高大豆苷元對SD大鼠脂代謝的影響。試驗選用30只平均體重211±9 g的75日齡的雌性SD大鼠,隨機分成5組,每組6只。各組在無豆日糧基礎上每天做如下處理:對照組,灌胃滅菌蒸餾水1mL；雌二醇組,灌胃雌二醇0.2mg；大豆苷元組,灌胃大豆苷元10mg；雌馬酚組,灌胃雌馬酚10mg；大豆苷元+菌組,灌胃大豆苷元10mg,并在試驗1、2、3及21日時灌胃雌馬酚產生菌ZX-7菌液1mL。試驗期為42天。試驗開始和結束后分別稱量每只大鼠

5、的體重,試驗過程中記錄各籠的采食量,以計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F:G)。試驗結束后測定體脂、血液及肝臟中脂質含量和肝臟中脂代謝相關酶活性。結果顯示,與對照組相比,各處理組SD大鼠的體重和肝臟重及體脂含量均有不同的程度降低,其中雌馬酚組的體重較對照組有顯著降低(P<0.05)。各處理對ADFI和F:G均無顯著影響(P>0.05)。血脂測定結果表明,大豆苷元可以顯著降低血液中總膽固醇(TC)的含量和低密度

6、脂蛋白膽固醇/高密度脂蛋白膽固醇(LDL-c/HDL-c)的比值(P<0.05)；雌馬酚對血液中TC、LDL-c/HDL-c、游離脂肪酸(NEFA)水平均有顯著的下調作用(P<0.05),但同時會使血液中甘油三脂(TG)的含量顯著升高(P<0.05)；大豆苷元+菌ZX-7可顯著降低血液中TC及LDL-c含量(P<0.05)；各處理組對肝臟TG含量均具有顯著下調作用(P<0.05),其中雌馬酚對肝臟TC、TG及NEFA水平的抑制作用均達到

7、了顯著水平(P<0.05)。肝臟脂代謝相關酶活結果顯示:大豆苷元、雌馬酚及大豆苷元+菌ZX-7均可顯著提高總酯酶酶活(TL=LPL+HL),同時抑制蘋果酸脫氫酶(MDH)的活性(P<0.05)。由此可知,大豆苷元及其降解產物雌馬酚均可抑制體重增長,降低體脂含量,促進大鼠肝臟中TC、TG的轉運和利用,抑制脂肪在肝臟內的堆積,雌馬酚較其前體大豆苷元在脂代謝調節(jié)中表現出更高的生物活性,外源灌胃雌馬酚產生菌株ZX-7可有效增強大豆苷元對機體脂肪

8、沉積的抑制作用。
　　 試驗二:大豆苷元及其降解產物雌馬酚對HL-7702細胞膽固醇代謝相關基因表達的影響
　　 本試驗以正常人肝細胞HL-7702為對象,通過研究不同濃度的大豆苷元及其降解產物雌馬酚(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和50μmol/L)對HL-7702細胞活性及膽固醇代謝相關基因表達的影響,比較分析大豆苷元及其代謝產物雌馬酚對肝細胞生長的影響及其在膽固醇代謝中的調控作用與機制。MTT

9、法結果顯示,大豆苷元及雌馬酚在HL-7702細胞增殖活性的調節(jié)中表現出較為明顯的劑量效應,0.1和1μmol/L大豆苷元和雌馬酚均可顯著促進細胞的增殖(P<0.01),10和50μmol/L大豆苷元及10μmol/L雌馬酚無顯著促進細胞增殖的作用,50μmol/L雌馬酚則對細胞增殖表現出明顯的抑制作用(P<0.01)。熒光定量PCR檢測細胞中膽固醇代謝相關基因LDL-R(低密度脂蛋白受體)、SREBP-2(固醇調節(jié)元件結合蛋白-2)和H

10、MGCR(3-羥基-3-甲基-輔酶A還原酶)基因的表達量結果顯示,50μmol/L大豆苷元及雌馬酚均可極顯著的促進細胞內LDL-R和HMGCR基因的表達(P<0.01),且雌馬酚的作用強度要高于大豆苷元。大豆苷元及雌馬酚對SREBP-2基因的表達均有一定的促進作用,但未達到顯著水平(P>0.05)。由試驗結果可知,大豆苷元及雌馬酚對肝細胞內膽固醇代謝調節(jié)作用的發(fā)揮可能是通過調節(jié)多個膽固醇代謝相關基因的表達來共同實現的。且不同基因對藥物濃

11、度的敏感性不同。在低濃度下,大豆苷元及雌馬酚可能通過激活細胞內SREBP-2途徑進而實現對其所調控的膽固醇代謝相關的下游靶基因的靶向調控作用,同時可能通過抑制肝細胞內HMGCR的表達進而抑制細胞內膽固醇的合成,抑制膽固醇在肝細胞內的累積。在高濃度水平下,大豆苷元及雌馬酚可能通過促進肝細胞表面LDL-R基因的表達,以促進血漿中膽固醇的清除。且在對LDL-R基因的表達調控中,雌馬酚較大豆苷元表現出更高的活性。
　　 試驗三:大豆苷元

12、及其降解產物雌馬酚對HL-7702細胞膽固醇代謝相關基因表達調控的雌激素受體依賴性分析
　　 本試驗以正常人的肝細胞HL-7702為對象,觀察大豆苷元和雌馬酚對細胞內膽固醇代謝相關基因LDL-R、SREBP-2和HMGCR的表達調控是否受雌激素受體拮抗劑(ICI182,780)的阻斷,以初步探討大豆苷元及其代謝產物雌馬酚對正常人肝細胞HL-7702中LDL-R、SREBP-2和HMGCR基因表達調控的雌激素受體依賴性。根據試驗2

13、的結果對三個基因的受體依賴性分析分別作不同的分組處理。LDL-R:Control、50μmol/L Daidzein、50μmol/L Equol、50μmol/L Daidzein+50μmol/L ICI182,780、50μmol/L Equol+50μmol/L ICI182,780；SREBP-2:Control、0.1μmol/L Daidzein、0.1μmol/L Equol、0.1μmol/L Daidzein+0.1

14、μmol/L ICI182,780、0.1μmol/LEquol+0.1μmol/L ICI182,780；HMGCR:Control、0.1μmol/L Daidzein、0.1μmol/L Equol、0.1μmol/L Daidzein+0.1μmol/L ICI182,780、0.1μmol/L Equol+0.1μmol/L ICI182,780。處理24小時后,收集細胞并用熒光定量PCR檢測細胞中LDL-R、SREBP-2、

15、HMGCR基因的表達量變化。結果發(fā)現,50μmol/L大豆苷元及雌馬酚對HL-7702細胞內LDL-R表達促進作用在加入等濃度的雌激素受體拮抗劑后消失,表明大豆苷元及雌馬酚對HL-7702細胞內LDL-R表達的促進作用可能依賴于細胞內雌激素受體的表達。大豆苷元及雌馬酚在0.1μmol/L的低濃度水平下均可不同程度的促進HL-7702細胞內SREBP-2的表達,但均未達到顯著水平(P>0.05),加入相同濃度的拮抗劑后,大豆苷元對SREB