1、柑橘產(chǎn)業(yè)是我國南方農(nóng)村的重要支柱產(chǎn)業(yè)，而每年由柑橘衰退病病毒(Citrus tristezavirus，CTV)造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。柑橘衰退病病毒屬于正義單鏈RNA病毒。由于利用RNAi技術(shù)進(jìn)行抗植物RNA病毒已有大量成功的報(bào)道，所以應(yīng)用RNAi原理進(jìn)行抗CTV育種可能成為解決CTV防治的有效方法。
　　 RNA病毒侵染植物時(shí)，一般表達(dá)沉默抑制因子使宿主植物細(xì)胞中RNAi機(jī)制鈍化從而達(dá)到成功侵染植物的目的。因此阻斷病毒的沉默抑制

2、因子的表達(dá)將有助于植物抵抗病毒的侵染，從而達(dá)到抗病毒的效果。本試驗(yàn)將CTV中三個(gè)沉默抑制因子p25、p20和p23作為RNAi靶標(biāo)序列，目的是要獲得對(duì)柑橘CTV有廣譜抗性的柑橘品種。
　　 (1)RNAi載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株的驗(yàn)證
　　 根據(jù)CTV基因組RNA中的沉默抑制因子p25、p20和p23的序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，經(jīng)RT-PCR成功克隆相關(guān)基因片段。利用重疊延伸PCR拼接法(Gene Splicing by

3、Overlap Extension，SOE)拼接PCR產(chǎn)物，獲得兩條多基因大片段P2520、P252023。
　　 為了便于克隆操作，在正向片段下游引物末端加上限制性內(nèi)切酶BglⅡ識(shí)別序列；在巢式PCR上游引物末端加上KpnⅠ識(shí)別序列，下游引物加上BglⅡ識(shí)別序列，經(jīng)TA克隆得到含兩個(gè)沉默抑制因子p25和p20基因片段的反向重復(fù)序列載體pTZ57R-HP2520。應(yīng)用同樣的方法得到含三個(gè)沉默抑制因子p25、p20和p23基因片段

4、的反向重復(fù)序列載體pTZ57R-HP252023。
　　 載體pTZ57R-HP2520與pCAMBIA-2301G經(jīng)SacⅠ和BamHI雙酶切，膠回收目的片段后用T4-DNA連接酶連接兩個(gè)片段，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒后用SacⅠ和BamHI雙酶切檢測(cè)目的片段。然后將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌LBA4404菌株。
　　 含有質(zhì)粒pCAMBIA2301-HP2520的農(nóng)桿菌被用來與錦橙上胚軸共培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株。本試

5、驗(yàn)共獲得了抗性不定芽20個(gè)，嫁接后再生成活7株，利用T-DNA區(qū)域內(nèi)的GUS基因特異引物PCR檢測(cè)6株為陽性，同時(shí)用NPTⅡ基因特異引物PCR檢測(cè)7株為陽性。
　　 應(yīng)用同樣的方法獲得RNAi雙元質(zhì)粒表達(dá)載體pCAMBIA2301-HP252023，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化錦橙上胚軸后誘導(dǎo)獲得抗性不定芽1個(gè)，嫁接再生成活1株，經(jīng)特異引物檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GUS基因和NPTⅡ基因均為陽性。
　　 (2)pCAMBIA2301-HP20轉(zhuǎn)基因酸

6、橙植株的評(píng)價(jià)
　　 分兩步對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的針對(duì)沉默抑制因子p20的單基因片段RNAi(pCAMBIA2301-HP20)轉(zhuǎn)基因酸橙植株進(jìn)行評(píng)價(jià)。首先，8株轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過GUS組織化學(xué)染色鑒定和針對(duì)p20基因的特異引物PCR檢測(cè)，證實(shí)所有的轉(zhuǎn)基因植株都成功的轉(zhuǎn)入了目的片段。其次，將轉(zhuǎn)基因植株嫁接備份后做攻毒試驗(yàn)，即對(duì)其中5株轉(zhuǎn)基因植株嫁接接種CTV強(qiáng)毒系TRL514。分別在接毒30d、50d和60d后用RT-PCR檢測(cè)CTV