1、Wnt4（Wingless-related MMTV integration site4，無翅相關的小鼠乳房腫瘤病毒整合位點4）是Wnt家族重要的成員之一，Wnt蛋白是一種分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌作用，它們組成一個高度保守的信號分子家族.Wnt通路決定細胞的分化命運，在動物發(fā)育中起著廣泛的作用；而近來研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在生殖系統(tǒng)中也起著重要的作用，與生殖最相關的可能是非典型的Wnt/β-catenin信號通路。因此，對Wn

2、t4基因的克隆測序和初步分析，可以為研究豬的Wnt4基因的生物學功能和品種改良提供基礎的基因信息。
　　 本文采用電子克隆的方法，結合RT-PCR和RACE技術，獲得了豬Wnt4基因的cDNA全序列。利用生物信息學方法預測了該蛋白的結構和功能，并進行了同源序列多重比對和分子系統(tǒng)發(fā)生分析。利用實時熒光定量( Real-time)PCR技術分析了豬Wnt4基因的mRNA在不同組織的相對表達水平。
　　 1 Wnt4基因的克隆

3、測序
　　 用人的Wnt4基因的cDNA全序列作為電子探針，分別從NCBI的dbEST和UniGene數(shù)據(jù)庫釣取了共5條豬的EST序列，將其輸入DNAstar-SeqMan程序，最后拼接出2個重疊群（Contig）序列。在此基礎上，利用Oligo6.0軟件手動設計引物，借助RT-PCR和RACE技術一方面驗證了電子克隆的正確性；另一方面擴增出cDNA全序列，長度為3232bp, GenBank登錄號為FJ759131.
　

4、　 2 Wnt4蛋白的生物信息學分析
　　 借助生物信息學網(wǎng)絡資源和軟件，預測出豬Wnt4基因開放閱讀框的長度為1254bp，編碼417個氨基酸殘基，且兩側分別是260bp的5’UTR和1718bp的3’UTR。通過對蛋白序列相似性檢索，預測出豬Wnt4蛋白含有一個信號肽，為分泌性蛋白質；不合明顯的疏水區(qū)；定位于細胞外。而且確定其含有Wnt4結構域。推測豬Wnt4蛋白參與細胞的分化、發(fā)育和繁殖等過程。
　　 3 Rea

5、l-time PCR分析Wnt4基因的組織表達譜
　　 利用Real-time PCR技術對豬各組織的Wnt4基因的mRNA進行定量分析，基因表達量使用2-△△CT法進行處理，其中△△CT=（CT目的基因-CT內參基因），處理結果使用SPSS16.0進行單因素方差分析。結果表明：Wnt4基因在豬的不同組織中廣泛表達，但Wnt4基因在體內各組織中的表達豐度有差異，已證實該基因最初表達于腎小管間充質及未分化的性腺中。但經(jīng)過性別特異的