1、主要組織相容性復合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)是脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的編碼免疫球蛋白樣受體(immunoglobulin-likereceptors)的基因群，與機體抗病力和免疫應答相關。MHC據(jù)結構與功能可分為MHCI，MHCII和MHCIII等三類，MHCII分子呈現(xiàn)在免疫系統(tǒng)特定的細胞表面，由α鏈和β鏈非共價鍵組成的一組高度多態(tài)性的跨膜糖蛋白。其中MHCII類分子只表達在有限種類的細胞表面，

2、如包括B淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞在內的專職性抗原遞呈細胞(APC)以及胸腺上皮細胞和激活的T淋巴細胞，在細胞免疫和體液免疫中起重要作用。MHCII類分子主要是在免疫應答的始動階段將經過處理的抗原片段遞呈給CD4+T細胞。MHCII類分子表達與否及其表達水平，直接決定免疫應答的發(fā)生及其強度，其表達水平的改變還參與某些自身免疫病、腫瘤、免疫缺陷等疾病過程的發(fā)生和發(fā)展，因此它在免疫學上具有重要的研究價值。為了探索鴨MHCII類分子在免疫

3、應答中的作用及其機理，本研究對其進行了克隆、表達及制備了多克隆抗體。 首先，據(jù)NCBI上已發(fā)表的鴨類MHCII的α鏈和β鏈基因序列與載體的多克隆酶切位點自行設計兩對引物，通過RT-PCR從北京鴨脾臟的總RNA中得到MHCIIα和MHCIIβ基因，將其克隆至pMD18-T上，經酶切分析及序列測定后，進一步亞克隆至原核表達載體pET-28a和pGEX-KG上。結果表明：本研究成功克隆了北京鴨MHCIIα和MHCIIβ鏈基因。MHCI

4、Iα大小為633bp，經測序與已登錄的基因序列同源性為99％，只有5個核苷酸的差異，導致2個氨基酸的改變；MHCIIβ大小為798bp，經測序與已登錄的基因序列同源性為92％，有61個核苷酸的差異，導致39個氨基酸發(fā)生改變。 其次，將上述構建成功的原核表達重組質粒pET-28a-α和pGEX-KG-β，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylthio-b-D-galactoside，I

5、PTG)誘導表達，獲得了融合蛋白MHCIIα和MHCIIβ；對表達條件誘導溫度、時間、誘導劑濃度、起始OD600值、通氣量、培養(yǎng)基pH及抗生素(Kan和Amp)濃度等進行了優(yōu)化，得出MHCIIα融合蛋白在誘導溫度為22℃，誘導3h，IPTG濃度為0.05mmol/L，起始誘導OD600值為0.45，通氣量70％，pH7.2，Kna50μg/ml時的表達量最高，而MHCIIβ融合蛋白的最佳誘導條件是在37℃，誘導3h，IPTG濃度為0.5

6、0mmol/L，起始誘導OD600值為0.45，通氣量70％，pH5.7，Amp50μg/ml，表達的融合蛋白均以包涵體形式存在。采用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法純化了MHCIIα和MHCIIβ包涵體，經過變性和復性，溶解的包涵體通過親和層析獲得了純度為90％以上的融合蛋白。 最后，利用純化的MHCIIα和MHCIIβ融合蛋白免疫小鼠制備多克隆抗體，經酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)與免疫印跡法(Westernblot)表明，制