1、擬穴青蟹等無脊椎動物依靠先天免疫系統(tǒng)識別、抵御入侵病原微生物，該防御過程需要宿主多種蛋白酶參與反應。絲氨酸蛋白酶及其同系物是生物體內重要的酶分子，它們不僅參與機體消化、胚胎發(fā)育、組織重建、細胞分化及血管形成等過程，而且在抵御病原菌入侵過程亦發(fā)揮重要作用。前期研究中，通過擬穴青蟹血細胞裂解上清液與病原菌互作技術分離獲得了能夠識別結合副溶血性弧菌的擬穴青蟹絲氨酸蛋白酶同系物(Sp-SPH)蛋白，為進一步了解Sp-SPH蛋白在擬穴青蟹識別和清

2、除入侵病原菌過程中的作用，開展了該項研究并取得如下成果:
　　 1.克隆獲得擬穴青蟹Sp-SPH基因全長cDNA。該基因的cDNA全長為1298bp，其中開放閱讀編碼框(ORF)1107 bp，5’端非翻譯區(qū)78 bp，3’端非翻譯區(qū)110bp，3’端非翻譯區(qū)具有典型的Poly(A)末端。
　　 2.構建了Sp-SPH基因的真核重組表達載體pPIC9K-Sp-SPH，利用親和層析純化獲得重組表達Sp-SPH蛋白。

3、　　 3.Sp-SPH蛋白能夠識別不同病原菌:利用Western blotting方法檢測體外重組表達Sp-SPH蛋白識別不同病原菌的結合活性，結果顯示重組Sp-SPH蛋白能夠識別多種病原菌（嗜水氣單胞菌，大腸桿菌模式株，金黃色葡萄球菌，河流弧菌，哈氏弧菌，副溶血弧菌）;ELISA檢測Sp-SPH蛋白與細菌或真菌細胞壁組分結合特性實驗發(fā)現Sp-SPH蛋白能夠識別并結合細菌細胞壁組分LPS、PGN及真菌細胞壁組分β-1，3-葡聚糖，其結

4、合能力具有一定的蛋白濃度相關性。
　　 4.Sp-SPH蛋白參與擬穴青蟹酚氧化酶原系統(tǒng)的激活。酚氧化酶原系統(tǒng)激活實驗顯示:加入Sp-SPH蛋白樣品的酚氧化酶活性是只有血細胞裂解上清液(HLS)對照樣品的2.5倍左右，并具有顯著性差異(P＜0.05)。結合3中研究結果，證明Sp-SPH蛋白識別病原菌后能夠激活擬穴青蟹重要先天免疫防御系統(tǒng)-酚氧化酶原系統(tǒng)，從而確定Sp-SPH蛋白是青蟹酚氧化酶原系統(tǒng)激活的重要輔助因子。
　　

5、 5.Sp-SPH重組蛋白能夠促進擬穴青蟹血細胞的粘附活性，并具有一定程度的濃度相關性，且在Sp-SPH蛋白濃度為48μg/mL時檢測到較高的細胞粘附活性，顯微鏡觀察結果也表明該濃度Sp-SPH蛋白樣品中的血細胞粘附數量明顯多于對照組。
　　 6.Sp-SPH蛋白能夠增強擬穴青蟹抵御特定致病菌感染的保護力。分別選取嗜水氣單胞菌（與Sp-SPH蛋白較強結合）、副溶血性弧菌（與Sp-SPH蛋白較弱結合）和解藻弧菌（不與Sp-SPH蛋