1、腫瘤個體化治療基因檢測教程,,教程目錄,第一章 病理常規(guī)操作第二章 樣本前處理（申請單填寫、標本類型、標本評估及登記等）第三章 樣本預處理（DNA、RNA提取及質量評估）第四章 基因操作（測序、片段分析及Q-PCR）第五章 結果解讀及診斷報告出具第六章 資料匯總，資料庫建立,第一章 病理常規(guī)操作,1. 病理樣本的接收2. 組織固定3. 取材4. 包埋5. 組織石蠟切片6. HE染色,1. 病理樣本的接收,,1．首先

2、核對病理申請單與標本上的紅色號碼是否一致。2．核查病理申請單上寫明的送檢標本及數(shù)目是否與實際送檢標本一致。3．觀察送檢標本的大小及固定液比例是否合適。(1)穿刺活檢及纖支鏡所取的小標本，4％中性甲醛(10％中性福爾馬林)固定組織的量應在6～10倍。(2)對于較大的手術切除標本，應及時切開固定；核對后將病理申請單和標本編上病理標本號。4．將病人姓名、性別、年齡、病歷號、科別、臨床診斷、部位、標本來源、標本例數(shù)等逐項錄入電腦存儲。5

3、．作為病理資料不僅要做好計算機錄入工作，還須進行文字登記，以便病理檔案長期保存。,2. 組織固定,臨床醫(yī)師切取標本后，應盡快將標本置于盛有足夠量固定液的容器內，盡量避免可能出現(xiàn)固定不及時或不充分導致標本干涸或腐敗，無法進行切片制作。添加的量應6～10倍于標本體積.,3. 取材及其后期處理,病理科病理醫(yī)生取材核對標本及其標志與申請單是否一致。按照病理取材規(guī)范選取病變及正常組織。對送檢標本進行大體描述。取材后的標本保存至少兩周。放

4、入自動脫水機進行水洗－脫水－透明－浸蠟前處理。,4.包埋,先將熔化的石蠟傾入模具，再用加熱的鑷子夾取已經(jīng)浸蠟的組織塊，注意：特定的制定面或最下面向下埋入熔蠟。注意標本的編號和標本要對準，防止污染。為下一步切片準備，提供介質。,5.切片,刀片鋒利，組織塊預冷。切5-10um的連續(xù)組織切片，置于玻片上。撈片，烘干。,6.HE染色,蘇木素－伊紅染色。蘇木素染細胞核（核酸），伊紅染細胞質（蛋白），使組織細胞對比清晰，便于顯微鏡下觀察。

5、主要流程：二甲苯脫蠟－梯度酒精脫二甲苯－蘇木素染色－分化、返藍－伊紅－梯度酒精、二甲苯－封片。,《臨床技術操作規(guī)范病理學分冊》 2004年第1版,第二章 標本前處理,一、申請單填寫1、登記患者基本情況，包括姓名、性別、年齡、送檢單位、床位、門診號/住院號、送檢日期、取材部位、病理診斷、標本病理號等2、患者簽署知情同意書，留下聯(lián)系方式3、患者病史及臨床情況,患者病史及臨床情況登記事項,有無手術（穿刺標本）手術時間 術前術后有無

6、化療，化療方案及化療效果及毒副作用（相關血項指標、胃腸反應、皮膚反應、神經(jīng)反應等），治療的單位。癌癥有無轉移，復發(fā)或者不能切除相關病史及家族史,,,送檢標本種類：,外周全血；胸腹水；痰；尿新鮮(冰凍)標本；內鏡活檢標本；手術標本蠟塊或切片,新鮮標本用10%中性福爾馬林固定或用RNAlater浸泡20分鐘以上（常溫可保存10天）外借病理蠟塊，常規(guī)病理大小即可常規(guī)石蠟切片（10張白片），5-10um，常溫送檢,送檢標本要求：,

7、樣本評估,血：保存溫度、時間，是否凝固胸腹水、尿及痰：涂片HE染色觀察結果是否有癌細胞蠟塊或白片：組織保存時間、福爾馬林固定時間、組織大小、有無癌細胞,將申請單登記入冊,登記基因檢測申請?zhí)?、姓名、送檢單位、病理號、檢測項目,腫瘤個體化治療基因檢測項目,腫瘤個體化治療基因檢測項目,腫瘤個體化治療基因檢測項目,腫瘤個體化治療基因檢測項目,,石蠟白片前處理1.烤片（90-95℃，0.5小時）2.脫蠟（過夜，最后一缸換新二甲苯）3

8、.HE染色4.鏡下區(qū)分選擇腫瘤組織4.刮片5.消化腫瘤組織（200μlTL+20μlOB酶，55℃2-3h消化時間視具體情況定）,第三章 基因檢測前處理,HE染色結果,,DNA的提取,1.血DNA的提取2.石蠟組織DNA的提取,血液DNA提取,250μl抗凝血加入250μl Buffer BL和25μl OB酶，70℃孵育15分鐘。加入260μl無水乙醇震蕩混合約20秒。取上清轉入收集柱中，12000rpm離心2分鐘。

9、將收集柱置一新收集管上，加入500μl HB solution，12000rpm離心2分鐘。加入700μl wash Buffer，12000rpm離心2分鐘?？账﹄x心，12000rpm2分鐘。將收集柱置一新1.5ml離心管上，加入50μl 70℃預熱的洗脫液，靜置5分鐘，12000rpm離心4分鐘洗脫，即為DNA模板。瓊脂糖電泳檢測提取DNA質量（或用分光光度計定量并記錄）。,Omega Blood DNA kit proto

10、col,石蠟DNA提取,在消化充分的組織中加入220μl BUffer BL，震蕩混合，于70℃孵育。加入220μl無水乙醇震蕩混合約20秒。取上清轉入收集柱中，12000rpm離心2分鐘。將收集柱置一新收集管上，加入500μl HB solution，12000rpm離心2分鐘。加入700μl wash Buffer，12000rpm離心2分鐘?？账﹄x心，12000rpm2分鐘。將收集柱置一新1.5ml離心管上，加入50μ

11、l70℃預熱的洗脫液，靜置5分鐘，12000rpm離心4分鐘洗脫，即為DNA模板。瓊脂糖電泳檢測提取DNA質量（或用分光光度計定量并記錄）。,Omega Tissuse DNA kit protocol,電泳圖,,RNA的提取,1.石蠟組織RNA的提取2.血RNA的提取 （化療后需1200微升血→白細胞太少）,1.石蠟組織RNA的提取,RNAlater樣本處理另注加入250μlbufferPKD和10μl的蛋白酶K,渦旋

12、混勻后，55°C孵育2-3h，80°C15min。然后加入500μl的bufferRBC，充分混勻。將溶液轉入gDNA Eliminator spin柱內，10000g離心30s，吸取收集管內液體至新的離心管，重復操作直至溶液都過濾收集柱。在溶液內加入1200μl無水乙醇，混勻，將溶液轉入RNeasy MinElute spin柱內，10000g離心15s，棄收集管內液體。加入500μl buffer RPE

13、，10000g離心15min，棄收集管內液體。加入500μl buffer RPE,10000g離心2min。小心將柱取出，放入一新的收集管內，最大速度離心5min（將柱蓋打開）將柱放入1.5ml收集管內，加入40-60μl無Rnase酶水，蓋上蓋子，室溫放置2min，最大速度離心1min洗脫RNA.,Qiagen RNEASY FFPE RNA kit protocol,2.血RNA的提取,300μl全血+1500μl 1

14、5; buffer ERL （150μl 10× ERL+1350μl H2O）混勻。同時做3管。冰上孵育10min，至半透明。450g 4℃，10min，棄上清。600μl 1× buffer ERL混勻，洗滌細胞。洗滌后合并3管液體。450g 4℃，10min，棄上清。600μl TRK裂解液+12μl β-巰基乙醇吹打混勻（可以暫時-70℃凍存）。加等體積70%乙醇，吹打混勻。將液體轉入HiBind

15、 RNA提取柱內（<800μl/次），10000g離心1min，棄收集管內液體，重復操作直至所有液體都過柱。加700μl RNA wash Buffer Ⅰ，10000g離心1min棄收集管內液體。換新的收集管，加500μl RNA wash Buffer Ⅱ，10000g離心1min棄收集管內液體。柱內加500μl RNA wash Buffer Ⅱ，10000g離心1min棄收集管內液體。12000g 空柱離心2min

16、。取一新的1.5ml離心管，在柱中央加入40μl洗脫液，12000g離心1min。核酸蛋白儀檢測提取RNA純度及濃度。-70℃保存RNA。,Omega Blood RNA kit protocol,,Quantifiler數(shù)據(jù)評估提取RNA質量OD260/OD280 1.8~2.0: 純度好 > 2.1: 核酸降解 < 1.6: 蛋白質污

17、染,第四章 基因操作,PCR擴增（以K-ras為例）,反應體系為：10×buffer dNTP(2mM) Mg2+TaqGenome DNAPrimer-F（10μM）Primer-R（10μM）H2O,2μl 2μl0.75μl0.25μl1μl0.4μl0.4μl13.2μl,,Total

18、 20μl,PCR反應條件： 置PCR擴增儀中95℃預變性15min，用TouchdownPCR，94℃變性50秒，63℃-58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共循環(huán)10次，94℃變性50秒，57℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共循環(huán)30次，最后于72℃延伸10分鐘。,電泳圖,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR擴增產物是否為單一目的條帶。,PCR產物純化,1.加100

19、μlPCR-A液，混勻，轉入純化柱內，室溫靜置10min，12000rpm離心2min。2.棄收集管內液體，加700μlwashing buffer，12000rpm離心2min。3.棄收集管內液體，加400μlwashing buffer，12000rpm離心2min。4.棄收集管內液體，12000rpm離心2min。5.柱內加30μl70°C預熱洗脫液，12000rpm離心2min。,測序反應（以K-ras為例）,

20、反應體系為：BigDye（2.5X） 0.8μl BigDyeSeqBuffer （5X） 1.6 μl Primer 0.3μlPCR純化產物

21、 1μlddH2O 6.3μlTotal 10μl,,測序產物純化,1.每管加1μlEDTA（125mM）;1μlNaAc（3M）到管里。2.每管加10

22、0μl100%酒精，震蕩混勻，室溫靜置15min。3.10°C;4000rpm離心30min，馬上倒置，1200rpm離心1min。4.每管加100μl70%酒精，5°C;4000rpm離心30min，馬上倒置，1200rpm離心1min。5.37°C;30min揮發(fā)凈酒精，加10μl Hi-Di溶解DNA。6.95°C；變性5min，4°C；4min，加樣上機。,片段分析操作,

23、步驟,1多重熒光PCR：15μlPCRmix＋五種（胃腸）或七種（尿）引物0.8μl（其中D17S283加1.2μl）＋1μlDNA.條件：95 °C15min，94 °C1min，56 °C1min，72 °C1min，30個cycle.２μlPCR產物＋0.4μlLIZ size standard+8μl HiDi,95 °C 5min, 4°C冰冷5min。上機，分析

24、數(shù)據(jù)。,Q-PCR操作,詳細步驟,1.RT反應:gDNA1μl+RNA 6μl；上機42°C，2min；離心。RT Buffer 2μl，RT酶0.5μl，Primer 0.5μl；上機A64程序。2.Q-PCR儀擴增 （反應體系）2×SYBR 2.5μl Primer 1(

25、5uM) 0.5μlPrimer 2(5uM) 0.5μlRT產物 1 μlNuclease-free water 1μl

26、 Total 5μl,,7900PCR儀反應程序,95°C 10min；95°C 15s；60°C 1min，40cycle。RQ Manager 1.2軟件分析實驗數(shù)據(jù)。,第五章 結果解讀及診斷報告出具,基因測序結果分析RNA表達量結果分析,測序結果圖及分析,ABI

27、3100測序儀測序，SeqScape v2.0分析結果為。以K-ras和EGFR為例,K-RAS 基因測序突變類型,K-ras :K2第12（GGT),13密碼子（GGC） K3第61（CAA）密碼子共9種突變類型：,GGT---GAT G12DGGT---GTT G12VGGC---GAC G13DGGT---TGT G12CGGT---GCT G12AGGT-

28、--AGT G12SGGT---CGT G12R,GGC---TGC G13CGGC---GCC G13AGGC---GTC G13V,,,7種 98%,3種 2%,,,EGFR基因測序突變類型：,EGFR 第18, 19 ,20, 21外顯子和第一內含子（CA）EGFR 19:容易發(fā)生缺失 EGFR 21:L858R EGFR(CA):(CA)n≤16，EGFR非突變NSCLC患者服

29、用TKI類藥物具有短期療效 EGFR 20:T790M 突變會使患者對EGFR-TKI 類藥物產生耐藥,EGFR18測序圖,EGFR19測序圖,EGFR20測序圖,EGFR21測序圖,EGFR intron 1測序圖,,RNA表達量結果圖及分析,使用儀器為：ABI7900熒光定量PCR儀，分析軟件為：RQ Manager 1.2,ERCC1,血液,石蠟組織,,BRCA1,血液,石蠟組織,,,RRm1,血液,石蠟組織,,,VEGF,血