1、實驗八 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化,實驗目的,1.了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學研究中的意義。2.學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法。3.學習將外源質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)入受體菌細胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。,實驗原理,轉(zhuǎn)化( Transformation )是將異源 DNA 分子引入另一細胞品系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究的基本實驗技術。,轉(zhuǎn)化中的受體細胞,轉(zhuǎn)化過程所用的受體

2、細胞一般是限制性修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，常用 RM 符號表示。,轉(zhuǎn)化方法：電擊法、 CaCl2、 RuCl等化學試劑法感受態(tài)細胞：的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源 DNA 分子通過時細胞的狀態(tài)。轉(zhuǎn)化細胞(轉(zhuǎn)化子)：帶有異源 DNA 分子的受體細胞( Transformant )。,實驗原理,實驗原理,本實驗以 E.coli DH5α 菌株為受體細胞，用 CaCl2 處理受體菌使其處

3、于為感受態(tài)，然后與 pUC18質(zhì)粒共保溫，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。 pUC18質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，因而使接受了該質(zhì)粒的受體菌具有抗氨芐青霉的特性，用 Apr符號表示。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細胞經(jīng)過適應稀釋，在含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。,,,,,,,抗Amp,,,宿主細菌,,,,,,,含Amp培養(yǎng)基,影響轉(zhuǎn)化率的因素,細胞生長狀態(tài)和密度。 轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA 的

4、質(zhì)量和濃度。 試劑的質(zhì)量。 防止雜菌和其它外源 DNA 的污染。,實驗儀器,超凈工作臺,臺式高速冷凍離心機,恒溫空氣搖床,恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)皿,實驗試劑,大腸桿菌DH5α  LB培養(yǎng)基，  0.1mol/LCaCl2溶液（預冷）  氨芐青霉素 pUC18質(zhì)粒,實驗步驟,菌株活化 感受態(tài)細胞制備 外源DNA的轉(zhuǎn)化,實驗步驟,菌株活化用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基平板

5、表面劃線，于37℃培養(yǎng)16小時挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)到3－5ml LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)3－5小時將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2－3小時，到OD600＝0.3－0.4,實驗步驟,感受態(tài)細胞制備將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，在冰上放置15－30min4000rpm離心5min,棄上清加入0.8ml預冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉淀，冰上預冷10min4000rpm離心5 min,棄上清加入0.2m

6、l預冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉淀，即可使用。也可加入總體積15％的甘油 可－70℃長期保存,實驗步驟,轉(zhuǎn)化 取目的DNA加入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，于冰上放置30min 于42℃水浴90S冰上放置2min加入800μl LB液體培養(yǎng)基于37培養(yǎng)1小時將培養(yǎng)液均勻涂布在含Amp+的培養(yǎng)基平板上將平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14個小時，然后觀察結果,對照組,對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代

7、替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現(xiàn)。 對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產(chǎn)生大量菌落。,轉(zhuǎn)化率,統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。 　　轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下： 　　轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反

8、應原液總體積／涂板菌液體積 　　轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(mg) 　　感受態(tài)細胞總數(shù)＝對照組２菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積／涂板菌液體積 　　感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細胞總數(shù),,實驗結果,實驗報告,寫明實驗目的、實驗原理、儀器、材料與試劑詳細列出實驗步驟；畫出實驗結果的示意圖并做分析，計算轉(zhuǎn)化效率。,1. 在制備感受態(tài)細胞的實驗中要注意哪些