1、微生物藥物產(chǎn)生菌的保藏和質(zhì)量控制,劉紅宇,2,微生物藥物產(chǎn)生菌微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化微生物藥物產(chǎn)生菌菌種保藏與質(zhì)量控制,主要內(nèi)容,,,,微生物藥物產(chǎn)生菌主要包括細(xì)菌、放線菌和真菌。被描述的微生物藥物大約近兩萬種。,抗細(xì)菌:青霉素(Penicillin) P. notatum降血脂:他汀類(Statins) P. brevicompactum, A. terreus, Monascus ruber免疫

2、抑制劑:環(huán)孢素(Cyclosporin A) Tolypocladium inflatum 抗真菌:棘白霉素類(Echinocandins) A. nidulans,一、微生物藥物產(chǎn)生菌,,,實(shí)驗(yàn)室必須建立和保存其所有菌種的進(jìn)出、收集、貯藏、確認(rèn)試驗(yàn)以及銷毀的記錄，應(yīng)有菌種管理的程序文件—2015中國藥典標(biāo)準(zhǔn)菌種的申購記錄；從標(biāo)準(zhǔn)菌株到工作菌株操作及記錄；菌種必須定期轉(zhuǎn)種傳代，并做純度、特性等實(shí)驗(yàn)室所需關(guān)鍵指

3、標(biāo)的確認(rèn)，并記錄；每支菌種都應(yīng)注明其名稱、標(biāo)準(zhǔn)號、接種日期、傳代數(shù)；菌種生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件；菌種保藏的位置和條件；其他需要的程序.,二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理,二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理,,,,,,對 活 純 性狀穩(wěn)定,微生物菌種實(shí)物管理微生物菌種信息管理保證菌種實(shí)物與信息的一致性,實(shí)物管理,信息管理,二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理,菌種的來源應(yīng)來自認(rèn)可的國內(nèi)或國外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，使用與標(biāo)準(zhǔn)

4、菌株所有相關(guān)特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株。 -2015版中國藥典,實(shí)物管理,信息管理,,標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇、復(fù)壯或培養(yǎng)物的制備應(yīng)按供應(yīng)商提供的說明或按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行;標(biāo)準(zhǔn)菌株如果經(jīng)過確認(rèn)試驗(yàn)證明已經(jīng)老化、退化、變異、污染等或該菌株已無使用需要時(shí)，應(yīng)及時(shí)滅菌銷毀；標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn)。 -2015版中國藥典,二、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種管理,,實(shí)物管理,信息管理,微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化,微生物藥物產(chǎn)生菌經(jīng)過多次傳代或長

5、期保持菌種的一個或多個優(yōu)良特性逐步減退或消失，稱為微生物藥物產(chǎn)生菌菌種的退化。,三、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化,在實(shí)際生產(chǎn)中，培養(yǎng)條件的變化也會導(dǎo)致菌種形態(tài)和生理上的變化，但是只要培養(yǎng)條件恢復(fù)正常，菌種原有性能就能恢復(fù)正常，因此培養(yǎng)條件引起的菌種變化是不能稱為菌種退化的。,藥用微生物產(chǎn)生菌菌種退化的鑒別,,,,,,微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化,微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化主要表現(xiàn)在微生物的形態(tài)、生理特性及微生物藥物生產(chǎn)能力等方面的變化：1.細(xì)胞

6、形態(tài)改變，產(chǎn)孢子能力下降。2.培養(yǎng)特征異常，典型性狀變?yōu)椴坏湫汀?.對不良環(huán)境如低溫、高溫條件或噬菌體的侵染的抵抗力下降。4.營養(yǎng)需求發(fā)生改變。5.在生產(chǎn)上常見的退化現(xiàn)象有：微生物藥物生產(chǎn)能力下降，生產(chǎn)的速度變慢。,三、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化,,,,,防止微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化的方法,,三、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化,1.控制轉(zhuǎn)接傳代次數(shù)2.采用良好的培養(yǎng)條件3.采用有效保藏方法,微生物藥物產(chǎn)生菌菌種退化的原因,1.自發(fā)突

7、變與回復(fù)突變2.細(xì)胞本身自我調(diào)節(jié)和修復(fù)3.環(huán)境條件的影響,,,,,,適合的菌種保藏方法保證菌種的存活并防止菌種退化,冷凍干燥保藏法 -80度低溫冷凍法 液氮超低溫保藏法,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低溫冷凍（低于-30℃）等方法保存；低于-70℃或低溫冷凍干燥方法可以延長菌種保存時(shí)間。---2015版 中國藥典,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,冷凍干燥保藏法,冷凍干燥保

8、藏法是將菌種懸液在凍結(jié)狀態(tài)下升華其中的水分,使得菌種處于干燥、低溫和缺氧的條件下，從而得以長期保存的菌種保藏法。原理：將含水量大的微生物菌種預(yù)先冷凍在真空條件下利用升華現(xiàn)象除去水分，細(xì)胞的生理活動趨于停止，從而能夠長期維持生活狀態(tài)。適用范圍：大多數(shù)細(xì)菌和放線菌。部分真菌和酵母菌。優(yōu)點(diǎn)：保存時(shí)間長、輸送、貯存方便等優(yōu)點(diǎn)。 缺點(diǎn)：冷凍干燥過程對細(xì)胞有損傷,操作步驟繁多，需要一定設(shè)備。,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,冷凍

9、干燥保藏法,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,安瓿管準(zhǔn)備,酸洗,水洗,蒸餾水洗,加標(biāo)簽及棉塞,滅菌,菌種,制備菌液,培養(yǎng)（固體或液體）,分裝安瓿管,安瓿管預(yù)凍,冷凍干燥開始,適當(dāng)升溫（促進(jìn)干燥）,凍干結(jié)束,安瓿管封口,檢查真空度,保護(hù)劑的選擇與準(zhǔn)備,分裝,滅菌,保藏（低溫避光）,,冷凍干燥過程的影響因素,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,冷凍干燥保藏法的影響因素,微生物菌種不同發(fā)育階段 菌體濃度 降溫速率

10、 保護(hù)劑、抗誘變劑及修飾劑的使用 合適的凍干曲線 二次抽真空 復(fù)水及培養(yǎng)條件,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,2024/2/17,-80度低溫冷凍法,將欲保存的菌種懸液密封于凍存管后儲藏于-80℃的冰箱中的保藏方法。原理：使微生物處于低溫狀態(tài)下使細(xì)胞的代謝減緩或趨于停止。 適應(yīng)范圍：各種類型微生物。優(yōu)點(diǎn)：簡便有效，在沒有液氮的地區(qū)購置深凍冰箱保藏菌種較易推廣。缺點(diǎn)：斷電或機(jī)械故障菌種易融化死亡。

11、,,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,2024/2/17,液氮超低溫保藏法,將欲保存的菌種懸液密封于凍存管中，經(jīng)控制速度凍結(jié)后，儲藏于-196℃ 的液態(tài)氮或-150℃的氣態(tài)氮中的長期保藏方法稱為液氮超低溫保藏法。原理：微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止。在此溫度下保藏，微生物處于休眠狀態(tài)，可減少死亡或變異。 優(yōu)點(diǎn)：保存時(shí)間長,死亡率低,變異少,活性相對穩(wěn)定。缺點(diǎn)：某些地方液氮不易得到適用范圍：各類微生

12、物,,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,-80度低溫凍結(jié)與液氮保藏比較,,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,2024/2/17,-80度低溫冷凍法 & 液氮超低溫保藏法的影響因素,微生物菌種的發(fā)育階段 菌體濃度 降溫速率 保護(hù)劑、抗誘變劑及修飾劑的使用 升溫速率及培養(yǎng)條件,,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法,微生物菌種不同發(fā)育階段與保藏的關(guān)系,細(xì)菌和酵母菌凍干靜止期菌齡的細(xì)胞，其存

13、活率高于對數(shù)生長期和衰老期的細(xì)胞，幼齡和老齡細(xì)胞均不適用。對于放線菌要求形成成熟的孢子為宜，而幼齡和老齡的細(xì)胞對凍干比較敏感。,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-影響保藏因素,菌體濃度對于抗生素產(chǎn)生菌存活力的影響,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-影響保藏因素,控制降溫速率,D.Smith等人應(yīng)用溫控冷凍光顯微術(shù)（Temperature-controlled Crygenic Light microscopy）觀察真菌在冷凍與融化過程

14、中引起細(xì)胞的損傷情況。發(fā)現(xiàn)不同種對于冷凍產(chǎn)生不同反應(yīng)冷凍光顯微術(shù)的使用，可以更直接觀察到冷凍速率對細(xì)胞的影響，指導(dǎo)降溫速率的控制，提高菌種的遺傳穩(wěn)定性。,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-影響保藏因素,控制降溫速率,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-影響保藏因素,據(jù)報(bào)道酵母合適的冷凍速度為3-10℃/min，乳酸菌為3-5℃/min，放線菌為1℃/min。,使細(xì)胞在凍干過程中免于死亡或損傷，并減少在保藏過程中的死 亡；作為支持物

15、和受體在復(fù)水過程中為干物質(zhì)提供一定的骨架結(jié)構(gòu)，防止復(fù)水時(shí)引起的死亡，并使菌體容易從休眠狀態(tài)恢復(fù)為生長發(fā)育狀態(tài)。 據(jù)報(bào)道適合的保護(hù)劑可以使微生物細(xì)胞的成活率接近99.8%。保護(hù)劑是保護(hù)性溶質(zhì)，通過氫和離子鍵對水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親合力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型，保護(hù)劑可替代結(jié)合水而穩(wěn)定細(xì)胞的構(gòu)型。對某些微生物，加保護(hù)劑反而有害。,保護(hù)劑的作用,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏影響因素,很多菌種保藏機(jī)構(gòu)如美國ATCC采用的保護(hù)劑多達(dá)有10

16、0多種。如脫脂牛奶、甘油、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸等通常與其他物質(zhì)混合使用。,保護(hù)劑的種類,,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏影響因素,不同保護(hù)劑對冷凍干燥后抗生素產(chǎn)生菌存活率的影響,不同保護(hù)劑對冷凍干燥后抗生素產(chǎn)生菌生產(chǎn)能力的影響,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏影響因素,,不同保護(hù)劑對冷凍干燥后抗生素產(chǎn)生菌生產(chǎn)力的影響,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏影響因素,抗誘變劑及修飾劑的使用,在菌種保藏過程中添加抗誘變劑

17、可以減少突變體產(chǎn)生，阻礙誘變劑同DNA的相互作用?？拐T變劑具有高度特異性?？拐T變劑主要有：嘌呤核苷酸、錳離子、L-甲硫氨酸、組氨酸、精胺、多氨、咖啡因等。近年來還發(fā)現(xiàn)一些修飾劑（如對氨基苯甲酸）對于鏈霉菌性狀的穩(wěn)定有實(shí)際意義。,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-影響保藏因素,,共晶點(diǎn)的概念,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-影響保藏因素,溶液隨溫度降低而發(fā)生凝固凍結(jié)，達(dá)到全部凝固凍結(jié)的溫度稱為凝固點(diǎn)或稱共晶點(diǎn)。不同物質(zhì)的凝固點(diǎn)不同。

18、由于凍干是在真空狀態(tài)下進(jìn)行的，只有制品全部凍結(jié)后才能在真空下進(jìn)行升華。,,保護(hù)劑與共晶點(diǎn),四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏影響因素,Eutectic Temperature, Glass-Transition Temperature, and Temperature Primary Drying Phase of Various Lyoprotectants,Na-gl, Na-glutamate; sm, skim milk;

19、Teut, eutectic temperature; Tg, glass-transition temperature; T prim. Dr. phase, primary drying phase; tr, trehalose.,,共晶點(diǎn)的測定,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏影響因素,當(dāng)溫度降低時(shí)電阻增大，當(dāng)降到共熔點(diǎn)時(shí)電阻即出現(xiàn)突然增大現(xiàn)象，此時(shí)的溫度即是該溶液物質(zhì)的共熔點(diǎn)。,1.保藏方法各個環(huán)節(jié)的細(xì)化和完善 降溫速率

20、的控制 保護(hù)劑 抗誘變劑的種類增多 共晶點(diǎn)測定 適合的凍干曲線2.玻璃化速凍 部分真菌保藏,四、微生物藥物產(chǎn)生菌菌種質(zhì)量控制-保藏方法新進(jìn)展,網(wǎng)址: http://www.cpcc.ac.cn地址: 北京市天壇西里1號，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所郵編: 100050微生物菌種購買和保藏, email: cpcc@cpcc.ac.cn Tel: 01063161934微生物菌種鑒定email: taxo