1、梅毒的實驗室檢測技術及進展,,梅毒概述實驗室檢測技術及臨床意義梅毒實驗室檢測策略探討,主要內(nèi)容,梅毒概述,梅毒起源于美洲，然后從美洲到西班牙，從歐洲到亞洲印度，1505年從印度傳入廣東嶺南（“廣東瘡”），后傳到全國各地。,少數(shù)民族地區(qū)居民梅毒感染率 = 10%牧區(qū)人群梅毒感染率 = 48%部分城市地區(qū)人群梅毒感染率 = 5%部分農(nóng)村地區(qū)人群梅毒感染率 = 2-3%（此幻燈片內(nèi)容源自中國疾病預防控制中心性病控制中心陳祥生教授

2、）,我國梅毒流行的歷史-經(jīng)濟繁榮的附帶品,5,,1350萬,,我國根據(jù)2011年全國HIV哨點監(jiān)測患病率結果進行初步估計：,我國梅毒疾病負擔占全球的比重？,我國占全球8%，亞太地區(qū)22%，是西太區(qū)平均水平的2倍,STD epi & control - Chen XS,我國梅毒報告疫情趨勢,隱性梅毒,一期梅毒,二期梅毒,胎傳梅毒,三期梅毒,7,梅毒報告病例數(shù)444,952例，甲乙類傳染病第3位淋病報告病例數(shù)103,085例，甲乙

3、類傳染病第6位,2013年全國梅毒、淋病病例報告,8,2011年全國HIV哨點監(jiān)測資料(NCAIDS),我國的梅毒在哪里？,9,重點人群中的梅毒高危人群？,10,我國預防與控制梅毒規(guī)劃,衛(wèi)生部2010年6月下發(fā)《中國預防與控制梅毒規(guī)劃（2010-2020年）》,STD epi & control - Chen XS,實驗室檢測技術及臨床意義,下列說法是否正確？,二期梅毒時，TPPA和RPR兩種血清學試驗100％陽性RPR只能用

4、于梅毒初篩RPR滴度應在1：8以上才能作為診斷隱性梅毒，梅毒血液標本的核酸檢測陰性，表明無梅毒螺旋體感染接受抗梅治療的嬰兒，隨訪18個月后TPPA試驗陽性，RPR試驗陰性可確診為胎傳梅毒----,12,常用梅毒實驗室檢測方法,病原學檢測血清學檢測,病原學檢查,原理：一期、二期梅毒時，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結穿刺術得到的組織液，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從

5、而可根據(jù)其特殊形態(tài)和運動方式進行檢測。方法：（1）暗視顯微鏡檢查 （2）鍍銀染色法 （3）核酸檢測（血液標本？）注：梅毒螺旋體目前體外人工培養(yǎng)還沒有獲得成功，僅能通過接種兔睪丸等部位進行有限增殖。,病原學檢查,不同標本核酸檢測研究初步結果：皮損部位標本：陽性率85%血漿標本陽性率：0%全血標本： 一期梅毒陽性率：0%

6、二期梅毒陽性率：36% 隱性梅毒陽性率：20%：,,病原學檢查的臨床意義,螺旋體檢查是診斷早期梅毒的最佳方法，對于患者的早期診斷、及時治療、預后和盡早切斷傳染源都有十分重要的意義。如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。,梅毒血清學檢測方法,(1) 非梅毒螺旋體抗原血清學試驗 （非特異性梅毒抗體）(2) 梅毒螺旋體抗原血清學試驗 （特異性梅毒抗體）兩類方法。問題：

7、為什么梅毒診斷需要上述兩類血清學檢測方法？,,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理,梅毒螺旋體一旦感染人體，宿主可對螺旋體表面的脂質(zhì)作出免疫應答，產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體（非特異性抗體）。未經(jīng)治療的病人，其血清內(nèi)的非特異性抗體可長期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，非特異性抗體可以逐漸減少滴度至轉(zhuǎn)為陰性。問題： 臨床上非梅毒螺旋體抗原血清學試驗為什么需要做定性和定量兩種檢測方法？,非梅毒螺旋體抗原血清學原理,方法包括： （1）快速血漿反應素環(huán)

8、狀卡片試驗 (RPR) （2）甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST） （3）性病研究實驗室試驗 (VDRL)等?；境煞质切牧字?卵磷脂和膽固醇抗原抗體結合形成復合物，凝集成網(wǎng)狀沉淀顆粒被肉眼所見上述方法的敏感性和特異性都基本相似,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理示意圖,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點,1、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)速？轉(zhuǎn)幅？,2、定性試驗加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中， 并均勻地涂布

9、在整個圈內(nèi)加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭加1滴抗原反應：水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘(23 ℃ -29 ℃） ，亮光下觀察結果,？滴/mL，1滴=？ul,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點,1、儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀，轉(zhuǎn)速、轉(zhuǎn)幅,2、定性試驗加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中， 并均勻地涂布在整個圈內(nèi)加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭加1滴抗原反應：水平旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)8分鐘(23 ℃ -29 ℃） ，亮光下觀察結果,6

10、0滴/mL，1滴=17ul,100r/min約18mm,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點,3、定量試驗稀釋夜準備：在反應紙板圈內(nèi)加入50uL生理鹽水（根據(jù)需要確定圈數(shù)),勿將鹽水涂開加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個圈內(nèi)。 下同定性試驗。,,,,,,,,,,,,,？,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:256,1:128,1:512,問題：定量試驗原倍血清滴度是多少？,問題：定

11、量試驗血清稀釋需要使用試管嗎？,TRUST 1:16,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗結果判斷,RPR 1:256,1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256,1:512,1:32,1:64,1:128,1:256,1:512,,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗臨床意義,早期梅毒（一期、二期）經(jīng)足量規(guī)則抗梅毒治療后 一期梅毒1年后轉(zhuǎn)為陰性 二期梅毒2年后轉(zhuǎn)為陰性

12、。 晚期梅毒 治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50%病人血清反應仍為陽性。,,非梅毒螺旋體抗原血清試驗臨床意義,非梅毒螺旋體抗原血清試驗方法簡單、快速、敏感性和特異性較好。適用于大量人群的篩查。因治療后血清滴度可下降并陰性，故可作為療效觀察、判愈、復發(fā)或再感染的指征。VDRL試驗用于神經(jīng)梅毒腦脊液檢測特異性高，檢測陽性可以作為神經(jīng)梅毒確診依據(jù)，但敏感性較低，即檢測陰性不能排除神經(jīng)梅毒。,,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗特點,假陽性反

13、應技術性假陽性反應一般是由于操作錯誤引起的假陽性反應，經(jīng)過重復試驗即可排除。生物學假陽性反應(一般滴度小于1:8），應采用梅毒螺旋體抗原血清學試驗如TPPA等進行排除。,梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理,抗原為梅毒螺旋體特異蛋白（包括螺旋體重組特異抗原），檢測梅毒患者血中特異性抗梅毒螺旋體抗原的抗體。感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗呈陽性，則患者終身陽性。問題：梅毒螺旋體抗原血清學試驗的定量試驗在梅毒診療中有意義嗎？,梅毒螺

14、旋體抗原血清學試驗方法,梅毒螺旋體顆粒凝集試驗 (TPPA) 梅毒螺旋體血球凝集試驗 (TPHA) 梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA） 化學發(fā)光免疫分析法（CLIA） 梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測 (RT) 熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（WB）,TPPA,TPPA試驗用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結合，產(chǎn)生可見的凝集反應，具有較高的敏感性和特異性。 TP

15、PA是目前WHO公認的梅毒抗原血清學試驗的“金標準”，常用于新方法、新試劑的參照標準。,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,明膠顆粒,梅毒抗原,,,+,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,抗原致敏顆粒,抗原致敏顆粒,血液中抗體,抗原抗體凝集,TPPA試驗原理示意圖,32,,4+： 粒子光滑覆蓋整個孔底，有時邊緣有折疊

16、3+： 粒子光滑覆蓋大部分底 2+：粒子光滑聚集覆蓋孔底，周圍有一細胞環(huán) 1+： 粒子光滑集聚覆概孔底，周圍有一明顯細胞環(huán) ±： 粒子沉集孔底，中央形成一小點 –： 粒子緊密沉積孔底中央,TPPA試驗結果判讀,a:均為RPR陽性標本,ELISA/ CLIA,ELISA試驗是用重組梅毒螺旋體抗原包被

17、固相板條，加上梅毒血清和單克隆抗體酶標記物，形成抗原抗體復合物與酶標記物結合，用酶聯(lián)檢測儀判定試驗陽性反應。本法可用于大樣本血清檢測?；瘜W發(fā)光法的臨床應用意義基本同ELISA化學發(fā)光法的敏感性？？,梅毒免疫層析快速檢測方法（全血法）,34,梅毒免疫層析快速檢測方法（血清、血漿法）,梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（WB）,熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS）,梅毒螺旋體抗原血清試驗臨床意義,作為非梅毒螺旋體抗原血清試驗(如RPR等)初

18、篩陽性標本的確證試驗，排除RPR 假陽性。不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，應結合非梅毒螺旋體抗原血清試驗結果進行診斷。梅毒螺旋體抗原血清試驗不能作為療效觀察的指標。,非梅毒螺旋體抗原血清試驗結果解釋示意圖,,,,,,,,,,,,,,,,早期,晚期,一期,二期,早期潛伏,,,,晚期潛伏,三期,治療前 治療后,陽性,陰性,梅毒螺旋體抗原血清試驗結果解釋示意圖,,,,,,,,,,,,,,,,,,,早期,一期,,二期,早期潛

19、伏,,晚期,,晚期潛伏,,三期,,治療前 治療后,陽性,陰性,梅毒血清學試驗結果解釋（梅毒臨床診斷參考依據(jù)）,41,問題：此結果解釋適用于先天（胎傳）梅毒嗎？,先天（胎傳）梅毒的實驗室診斷依據(jù),查到螺旋體其抗心磷脂抗體滴度持續(xù)上升其抗心磷脂抗體滴度高于其母親四倍（2個稀釋滴度）檢測抗梅毒的IgM特異性抗體陽性隨訪18個月觀察抗體的變化（哪一類抗體？） 《預防艾滋病、梅毒和乙肝母嬰傳播工作實施方案》,

20、問題：IgG抗體和IgM抗體有什么區(qū)別？,梅毒IgM抗體（TP-IgM）,IgM抗體的產(chǎn)生是感染后的早期體液免疫應答反應。IgM分子比IgG較大，所以IgM抗體不能通過胎盤屏障。而母親的IgG抗體可以通過胎盤屏障傳給胎兒。因此若在新生兒血中檢測到IgG抗體不能作為先天梅毒的診斷依據(jù)，而IgM抗體可為先天梅毒的診斷依據(jù)。 IgM抗體檢測其特異性較高，但敏感性較低。因此，IgM抗體檢測陰性，不能排除先天梅毒感染。,4

21、3,先天（胎傳）梅毒的實驗室診斷依據(jù),查到螺旋體其抗心磷脂抗體滴度持續(xù)上升其抗心磷脂抗體滴度高于其母親四倍（2個稀釋滴度）檢測抗梅毒的IgM特異性抗體陽性隨訪18個月觀察抗體的變化（特異性抗體）,梅毒實驗室檢測策略探討,梅毒實驗室檢測策略思考,,,46,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗,梅毒螺旋體抗原血清學試驗,,排除試驗假陽性確證梅毒螺旋體現(xiàn)癥感染,,排除治愈的既往感染者確證梅毒螺旋體現(xiàn)癥感染,？RPR：初篩試驗 TPPA

22、：確證試驗,梅毒實驗室檢測策略思考,方法選擇依據(jù)敏感性、特異性（試劑評估）操作流程（可及性）試劑的價格、結果時間（可接收性）,47,？初篩目的和方法選擇,規(guī)范化梅毒實驗室檢測要求,根據(jù)目的選擇檢測方法及檢測策略。可采用任何一類梅毒血清學檢測方法作為篩查試驗。,49,血清學檢測試劑的種類,50,,,,51,陽性,,,下列說法是否正確？,二期梅毒時，TPPA和RPR兩種血清學試驗100％陽性RPR只能用于梅毒初篩RPR滴度應在1