1、第七章 放射免疫技術,第一節(jié)　放射免疫技術 一、原理及分類 二、常用的放射性核素 三、標記物制備及鑒定 四、抗血清鑒定,第二節(jié)　放射免疫分析 一、基本原理 二、實驗方法及測定第三節(jié) 免疫放射分析 一、基本原理 二、IRMA與RIA的比較,思考題小結,免疫技術：以抗原-抗體反應原理為基礎，對樣品中相應抗原或抗體進行檢測。標記技術：將可被探測的示蹤物質用化學方法與化合物連接。標記免疫分析：用可微

2、量或超微量檢測的示蹤劑標記抗原、抗體，檢測免疫反應結果并確定待檢物。,標記免疫技術－基本概念,,常見標記免疫技術,放射免疫技術酶免疫技術熒光免疫技術,第一節(jié) 放射免疫技術,早期的放射免疫技術是基于競爭性結合反應原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又發(fā)展了非競爭性結合的免疫放射分析(IRMA)。該類技術具有靈敏度高、特異性強、重復性好、樣品及試劑用量少、操作簡便且易于標準化等優(yōu)點，廣泛應用于生物醫(yī)學研究和臨床診斷領域中各種微量蛋白質

3、、激素、小分子藥物和腫瘤標志物的定量分析，對相關學科的發(fā)展起到了極大地推動作用。,放射免疫RIA以標記抗原與反應系統(tǒng)中未標記抗原競爭結合特異性抗體來測定待檢樣品中抗原量。,免疫放射IRMA以過量標記抗體與抗原非競爭結合，采用固相免疫吸附載體分離游離和結合標記抗體。,放射受體分析RRA放射配體結合分析RBA,其它,一、放射免疫技術－原理及分類,二、放射免疫技術－常用的放射性核素,125I

4、 3H 射線 γ β理化性 活潑 差核素豐度 >90% －半衰期 60.2d 12.3y標記方法

5、 簡單 復雜標記設備 低廉 昂貴測量條件 簡單 復雜,,,常用標記核素,125碘-標記物的制備－標記,125I-,化學或酶促反應，將放射性負電碘離子氧化成碘原子或正電碘離子，通過取代反應置換被標記物分子中酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基

6、上的氫原子。,125I或125I+,125I-標記物（混合物）,,,Ch-T、LPO氧化,取代反應,直接標記法,三、放射免疫技術－標記物制備及鑒定,,,,,,,使用無還原劑的高比放射性碘源被標記物用量要少ch-T用量要低控制總反應體積<200μl反應時間1-2分鐘弱堿性反應條件,間接標記法,聯(lián)接標記( bolton-Hunter )預先將125I用ch-T法標記琥珀酰胺酯，制成的125I 化脂功能基團可與蛋白分子上的

7、氨基酸殘基反應，從而使待標記物被碘化。,,,bolton-Hunter,,,125碘-標記物的制備－純化,凝膠過濾法離子交換層析法 聚丙烯酰胺凝膠電泳 高效液相色譜法,聚合、損傷物,標記蛋白,游離125I,125碘-標記物的制備－鑒定,標記物質量高比放射性高純度完整免疫活性,放射化學純度單位標記物中結合于被標記物上的放射性占總放射性的百分率應大于95%,免疫活性標記物與抗體結合的能力標記物與過量抗體反應百分比

8、該值越大, 標記物免疫活性好,比放射單位化學量標記物中所含的放射性強度單位：Ci/g mCi/mg Ci/mmol 比放射性過高，將影響標記物免疫活性,計算法：依據(jù)標記反應中放射性核素的利用率（標記率）來計算標記物的比放射性.自身置換法 ：比較標記抗原與標準抗原的免疫活性來測定標記物的比放射性,結果準，測定復雜,比放射性－計算法,,結果欠準，計算簡便,自身置換曲線 反應系統(tǒng)：限量Ab和

9、遞增劑量(cpm)的標記抗原標記抗原的結合率(B/T%)隨標記抗原總量的增加而減少 兩條曲線平行,若標記抗原與標準品抗原具有相同的免疫活性,標準曲線 反應系統(tǒng):抗體（限量）、標記抗原（定量）和劑量遞增的標準抗原組成 標記抗原與抗體的結合率(B/T%)隨標準抗原的增加而競爭抑制性減少,比放射性－自身置換法,標準曲線與自身置換曲線平行表明在相同的放射性結合水平上，二實驗中抗體上結合 的抗原物質總量相同計算置換曲線平行段某結

10、合率的放射性強度(cpm/ml換算 為nCi/ml) 計算標準曲線平行段相應結合率對應的標準抗原化學量 (ng/ml)以平行段多點結合率對應的放射強度和標準抗原量進行直 線回歸，其斜率即為比放射性(nCi/ng),四、放射免疫技術－抗血清鑒定,抗體分子上一個抗原結合部位與相應的抗原決定簇之間的結合強度用親和常數(shù)Ka表示。單位為稀度單位（LM-1）Ka值高（109～12L/mol）有助于提高靈敏度、精確

11、度和準確度,親和性,親合力高,親合力低,放射免疫技術－抗血清鑒定,特異性:指一種抗體識別相應抗原決定簇的能力交叉反應率：將反應的最大結合率抑制下降50% 時特異性抗原與類似物的劑量（ED50）之比抗體交叉反應程度直接影響測定結果的準確性,特異性,效價,五、方法學評價,除了常規(guī)的靈敏度、精密度、準確性、特異性和穩(wěn)定性之外，應注意以下指標：可靠性劑量-反應曲線高劑量鉤狀效應,第二節(jié) 放射免疫分析,一、放射免疫分析－基

12、本原理,競爭性結合反應的經(jīng)典標記抗原（Ag*）和非標記抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競爭性結合Ag*和Ag具有等同的與Ab結合能力,,Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab結合位點，二者通過競爭方式與Ab結合；隨著Ag增加，Ag*與Ab結合形成Ag*Ab復合物的放射量降低,二者變化成函數(shù)關系。,,以未結合的Ag*為F，Ag*Ab復合物為B，則B/F或B/(B＋F)與Ag的量變存在著函數(shù)關系－劑量反

13、應曲線,,注：T即是B與F的總和,二、放射免疫分析－實驗方法及測定,抗原抗體反應,Ag*,Ag,,,反應條件體積溫度時間pH,Ab,(標準Ag/樣品Ag),平衡非平衡一步法二步法,分離結合、游離標記物,二抗體沉淀法,PEG 沉淀法,PR 試劑法,活性炭吸附法,,分離徹底，迅速分離試劑和過程不影響反應平衡效果不受反應介質影響 操作應簡單、重復性好經(jīng)濟,測量、數(shù)據(jù)處理,晶體閃爍計數(shù)器 包括了NaI閃爍晶 體

14、、光電倍增管 以及計數(shù)器測量的放射性信 號是儀器輸出的 電脈沖數(shù)：每分 鐘計數(shù)(cpm),計算,參數(shù)cpmB/T (%)F/T (%)B/F (%)B/B0 (%),擬合,注：T即是B與F的總和,第三節(jié) 免疫放射分析,一、免疫放射分析－基本原理,以過量125I標記抗體與待測抗原進行非競爭性免疫結合反應, 用固相免疫吸附劑對B或F進行分離，其靈敏度和可測范圍均優(yōu)于RIA操作也較RIA簡單。,單

15、位點 IRMA,先用過量標記抗體與待測抗原進行反應，形成抗原抗體復合物；用固相抗原結合未結合標記抗體并將其分離, 測定上清液的放射量,雙位點 IRMA,先用固相抗體與抗原結合，再用過量的標記抗體與抗原的另一決定簇結合，形成固相抗體-抗原-標記抗體復合物，洗棄剩余標記抗體，測固相上放射性。,二、IRMA與RIA比較,放射免疫分析技術的靈敏度高、特異性強、精密度好, 常用于各種激素、微量蛋白質、腫瘤標志物和藥物等微量物質

16、的測定。但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期不長等諸多不足, RIA將逐漸被取代。,放射免疫分析技術的應用,1.放射免疫技術的核心是什么？2.制備放射性125I標記物的基本原理是什么？有哪些方法？3.評價125I標記物質量的指標有哪些？4.用于放射免疫技術的抗體應滿足哪些質量標準？5.放免分析中標記/未標記抗原、抗體的用量特點及與免疫復合物的量變關系？6.反應結束后，如何將免疫復合物與游離標記物分離開？7.放

17、射免疫分析實驗中，如何確定待測抗原的含量？8.免疫放射分析與放射免疫分析的反應原理有何不同？9.γ閃爍計數(shù)器記錄的信號即是放射核素的衰變嗎？10.靈敏度、特異性和測定范圍，免疫放射分析與放射免疫分析有何區(qū)別？,思考題,放射免疫技術的基本原理是放射性核素可探測的靈敏性、精確性與抗原抗體反應的特異性相結合，主要包括RIA和IRMA。RIA所用的標記物應具備高比活度、高純度和完整的免疫活性；抗血清應具有較高的抗體親和力、高度的特異性和適