1、內毒素和1，3-β-D-葡聚糖檢測的臨床應用,,主要內容,來源及結構,生物學活性,檢測的臨床應用,檢測方法及參考范圍,標本采集及影響因素,,,內 毒 素,內毒素的生物學活性,,內毒素的結構,,特異性多糖,核心多糖,類脂A,內毒素概述,內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁結構中的脂多糖（LPS），這些成分只在細菌死亡裂解后才釋放到菌體外或活菌以發(fā)泡形式將其釋出。,內毒素的有益作用,,內毒素血癥產生原因,,,,有效的抗菌治療后，細菌崩解,,輸入

2、了含有細菌的藥物、血液或者體液等。,各類疾病內毒素血癥的發(fā)生率,肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、燒傷85%、急性胰腺炎90%、敗血癥70%、急性肝炎37-64%、暴發(fā)性肝炎58-100%、丙肝60%、膽石癥伴急性梗阻性化膿性感染85%、多器官功能衰竭100%。,內毒素檢測的臨床應用,,,內毒素檢測在醫(yī)院中的應用,,內毒素血癥的臨床癥狀,內毒素血癥臨床癥狀主要決定于宿主對內毒素的抵抗力。癥狀和體征有：發(fā)熱，白細

3、胞數變化，出血傾向，心力衰竭、腎功能減退、肝臟損傷、神經系統(tǒng)癥狀，以及休克、血壓下降、組織灌流不足、缺氧及酸中毒等。 ▲最嚴重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等。病死率極高。,內毒素的檢測方法,鱟試驗是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鱟的變形細胞與微量內毒素產生凝集反應的現(xiàn)象，作為判斷試劑中細菌內毒素含量的一種方法。,內毒素的檢測方法,1.凝膠法：鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來定性檢測或半定量內

4、毒素的方法2.濁度法：利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量3.比色法：利用鱟試劑與內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團的多少而測定內毒素含量4.流式細胞術：測內毒素的量而不是活性5.化學發(fā)光測定法,內毒素的檢測原理,革蘭陰性菌脂多糖檢測試劑盒（光度法）檢測原理：革蘭陰性菌脂多糖能激活酶反應主劑中的C因子、B因子、凝固酶原等，引起凝固蛋白原轉變成凝固蛋白從而引起吸光度變化，根據檢測其溶液

5、吸光度變化對革蘭陰性菌脂多糖濃度進行測定。,,,,MB-80微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng),內毒素檢測的參考值,檢測值﹤10pg/ml,陰性。檢測值介于10～20pg/ml之間，臨床觀察期，建議動態(tài)采血檢測。檢測值﹥20pg/ml，陽性，建議臨床結合癥狀進行治療。,檢測方法的局限性,只能檢測革蘭陰性菌脂多糖含量，不能區(qū)分細菌種屬。,檢測樣本的采集與保存,檢測樣本：血液采集要求：采樣過程要求無菌操作，用專用的無熱原真空采血管（肝素類抗凝

6、）。常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血/取樣（血透患者透析前采血）。樣本保存：樣本采集后應在3000轉/分進行離心，若不能及時檢測，應將血漿轉移至無熱原試管內，在-30℃冰箱中冷凍保存，一周內使用。特殊標本處理 ：對一般黃疸、溶血、乳糜血標本，稀釋2-5倍后進行檢測 ；對于嚴重的黃疸、溶血、乳糜血標本，應重新采血。,干擾因素,1.應用某些抗生素如β-酰胺內酯類、喹諾酮類等患者；2.一些蛋白：陽離子蛋白如溶菌酶、核糖核酸酶A及人免疫球蛋

7、白G均能與內毒素形成細菌內毒素--蛋白復合體，對細菌內毒素有顯著的屏蔽作用，而影響測定內毒素結果；3.操作環(huán)境及操作過程中的污染，可能造成假陽性。,,,,,(1-3)-?-D-葡聚糖,1-3-β-D-葡聚糖本質及特點,,(1-3)-β-D-葡聚糖特性,1.對熱極為穩(wěn)定，高壓21℃并不能使其滅活。在念珠菌和曲霉菌細胞壁中含量較多，對G試驗靈敏。2.當真菌進入人體血液或深部組織后，經吞噬細胞的吞噬、消化等處理后，(1-3)-β-D-葡聚

8、糖可從胞壁中釋放出來，從而使血液及其它體液中含量增高。當真菌在體內含量減少時，機體免疫系統(tǒng)可將其清除。3.在淺部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被釋放出來，故其在體液中的量不增高。,侵襲性真菌感染的定義,侵襲性真菌感染( invasive fungal infection, IFI)定義: 指致病性真菌侵犯皮下組織、黏膜、肌肉和內臟器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性較大。,侵襲性肺部真菌感染,侵襲性真菌感染的發(fā)

9、病率逐年上升,其中又以侵襲性肺部真菌感染最常見,大約占50%～60%。未經及時治療的肺部真菌感染患者的病死率可高達30% ～80% 。,侵襲性肺部真菌感染,臨床表現(xiàn)：缺乏特異性,多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咳血、胸悶、呼吸困難等。 現(xiàn)狀：兩高兩低一快 高院內感染率和病死率，低臨床和實驗 室診斷率，患者病情惡化快。 （檢測方法相對滯后,早期診斷和治療仍存在困難,副作用小的新型抗真菌藥物價格昂貴

10、,導致病死率高。）,侵襲性真菌感染的誘因,內源性誘因： 影響機體抵抗力的各種疾病，如白血病、癌癥、結核、肺膿腫、糖尿病、肝臟疾病以及維生素缺乏等。外源性誘因： ▲廣譜抗生素，抗腫瘤藥物和免疫抑制劑； ▲插管等侵襲性治療，骨髓和實體器官移植； ▲免疫缺陷綜合癥。,侵襲性真菌感染診斷困難的原因,診斷困難的主要原因：臨床表現(xiàn)不典型，易被基礎疾病所掩蓋確診常需侵入性手段獲得組織標本，侵入性操作常因患者的病情所限難以實施真

11、菌檢測項目開展相對不足或滯后,,,侵襲性真菌感染的特點,不產生內毒素和外毒素，致病機理不明；致病力一般較弱，機體免疫低下時發(fā)生；感染菌種變化：白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增長趨勢上升明顯；早期癥狀無特異性，往往被原發(fā)病掩蓋，病程長，發(fā)現(xiàn)較晚，死亡率高。,主要可引發(fā)侵襲性真菌感染的疾病,呼吸系統(tǒng)疾?。悍窝住⒎卫w維癥感染及寄生蟲?。悍谓Y核、腹腔內膿腫、AIDS循環(huán)系統(tǒng)疾病：腦出血、腦梗塞、硬膜下血瘤術后、胸部大動脈瘤術后內分泌

12、疾?。禾悄虿⊙杭霸煅鞴偌膊。涸偕系K性貧血、DIC腫瘤類：胃癌，肝癌，肝內膽管癌，肺癌，多發(fā)性骨髓瘤，白血病，惡性淋巴瘤,“G”試驗,1-3-β-D-葡聚糖可特異性激活鱟變形細胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱G試驗。,G試驗檢測評價,BG值在侵襲性真菌感染臨床表現(xiàn)出現(xiàn)之前就已經高于正常值相關報道5例確診IFI及3例臨床診斷的IFI患者，發(fā)現(xiàn)BG值升高出現(xiàn)在發(fā)熱、咳嗽、胸痛等癥狀和肺部CT檢查發(fā)現(xiàn)以前 。平均早于發(fā)熱5

13、d早于呼吸道癥狀10d,G試驗臨床應用,1　明確診斷　?。拐婢幬镏委熐埃?　治療效果監(jiān)測　　（抗真菌藥物治療后）　3　連續(xù)2次采血進行G試驗,,侵襲性真菌感染的臨床檢測方法,直接培養(yǎng)真菌法--敏感性低，耗時長, 培養(yǎng)陽性率低。培養(yǎng)結果是定性的，有些標本采集困難G試驗：通過檢測(1-3)-β-D-葡聚糖的含量，判斷是否有真菌感染。耗時短，靈敏度高，特異性強，定量檢測可判斷感染嚴重程度PCR技術：真菌的抗原、抗體及代謝產

14、物的血清學檢查和真菌核酸檢測,,真菌1-3-β-D葡聚糖檢測原理,真菌1-3-β-D葡聚糖檢測試劑盒（光度法）檢測原理：真菌1-3-β-D葡聚糖能特異性激活反應主劑中的G因子、凝血酶原等，發(fā)生酶的級聯(lián)反應從而引起吸光度變化，根據檢測其溶液吸光度變化對真菌1-3-β-D葡聚糖濃度進行定量。 試劑中添加的兩性電解質甘氨酸、氨基糖苷類抗生素及表面活性劑可抑制脂多糖對B、C因子的激活，對革蘭陰性菌脂多糖有特異性屏蔽作用。,,,MB-80微

15、生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng),真菌1-3-β-D葡聚糖參考值,檢測值﹤60pg/ml,陰性。檢測值介于60～100pg/ml之間，臨床觀察期，建議動態(tài)采血檢測。檢測值﹥100pg/ml，陽性(深部真菌感染)，建議臨床結合癥狀進行治療。,,檢測方法的局限性,只能檢測真菌1-3-β-D葡聚糖的含量，不能區(qū)分真菌種屬，不能檢測結合菌和隱球菌。,,內毒素與β-葡聚糖的檢測比較,已知能與鱟試劑發(fā)生反應的物質有細菌內毒素和真菌1-3-β-D葡聚糖，但它

16、們的反應曲線不一樣。內毒素反應曲線為S型特征曲線，而β-葡聚糖反應曲線為經過0點的斜線。,念珠菌顯色培養(yǎng)基的菌落顏色,對于念珠菌血癥, G試驗檢測是首選檢查熱帶念珠菌----灰藍色白色念珠菌 ----綠色克柔念珠菌----粉紅色光滑念珠菌----紫紅色,標本采集及保存,檢測樣本：血液、肺細胞灌洗液采集要求： 1.采樣過程要求無菌操作，用專用的無熱原真空采血管； 2.常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采

17、血，血透析患者透析前采血,,,標本采集及保存,及時送檢，及時檢測：2-3h內檢測不合格標本：嚴重黃疸、溶血、乳糜標本會影響測結果，需重新采血進行檢測。,,,干擾因素,據報道可能產生假陽性的原因有： 1.應用纖維素膜進行血液透析患者; 2.某些紗布或其他醫(yī)療物品中含有葡聚糖; 3.靜脈制劑（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白）等含有葡聚糖;,,,干擾因素,4.某些細菌敗血癥患者（尤其是鏈球菌敗血癥）; 5.抗腫瘤類藥物(香

18、菇多糖、裂殖菌多糖); 6.磺胺類藥物; 7.蘑菇類食物;,,,臨床細菌內毒素及(1-3)-?-D-葡聚糖檢測的國內外發(fā)展,國外：血液（包括血漿、腦脊液、血清、腹水液、尿液、唾液、乳汁等）中內毒素以及(1-3)-?-D-葡聚糖微量定量檢測已經成為現(xiàn)實，目前在美國、日本等國均已出現(xiàn)專用細菌內毒素及(1-3)-?-D-Glucan檢測儀器及配套的檢測試劑盒，而且獲得FDA及厚生省批準文號，作為一種日常檢測項目。,,,臨床細菌內毒素