1、流式細胞術的發(fā)展史,1934年細胞在顯微鏡載物臺的毛細管中流過。1949年流動的懸浮粒子計數(shù)方法—Coulter效應。1967年發(fā)展了一種液流束、照明光軸、檢測系統(tǒng)三者垂直的流失細胞儀。80年代出現(xiàn)了完善的流失細胞儀。,概 述,流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）是一種自動分析細胞的高技術，其原理是懸浮在液體中的分散細胞一個個地依次通過測量區(qū)，當每一個細胞通過測量區(qū)時產(chǎn)生電信號，這些信號可以代表熒光、

2、光散射，光吸收或細胞的阻抗等。這些信號可以被測量、存貯、顯示，于是細胞的一系列重要的物理特性和生化特性就被快速地、大量地測定。,上述特性可以是細胞的大小、活性，核酸的數(shù)量、酶、抗原等等。儀器還可以根據(jù)所規(guī)定的參量把指定的細胞亞群從整個細胞群體中分選出來。 流式細胞術在當前的細胞生物學、免疫學、腫瘤學、血液學、遺傳學、病理學、臨床檢驗學等各領域有著十分廣泛的用途。,流式細胞術是對懸液中的細胞或細胞器進行快速可達每秒鐘數(shù)千個乃至上萬個

3、細胞。這樣，它就可與顯微鏡相互補充。顯微鏡術可以研究組織的結(jié)構、細胞定位和熒光在細胞中的分布；而多數(shù)流式細胞術是一種零分辨率的儀器，它只能測量一個細胞的總核酸，總蛋白等而不能測量細胞中某一特定部位的核酸或蛋白，這是它的不足之處。,由于現(xiàn)代熒光技術和多參數(shù)相關測量技術的發(fā)展，流式細胞術在細胞群體或組成群體的亞群進行定量分析時，又具有其他手段無法比擬的優(yōu)越性。 用飛點掃描技術或縫隙掃描技術得到了細胞形態(tài)學方面低分辨率的信息，從而改變了

4、流式細胞儀零分辨率的傳統(tǒng)觀點。,流式細胞儀的結(jié)構,FCM是由細胞流動室、光源、聚光裝置、信號檢測器、電子計算機及高級別儀器具有的細胞分選裝置構成。,細胞流動室,細胞流動室是FCM的心臟，它是根據(jù)流體力學中的層流鞘液原理設計而成，其結(jié)構包括石英小室形成的鞘液腔及插入其中的樣品管。細胞呈單個排列通過流動室。,光源,常用激光器：氫離子激光器 488nm蘭色激光氬離子激光器氪離子激光器,聚光系統(tǒng)和檢測系統(tǒng),透鏡、小孔、多種濾片檢測器、放

5、大器將光信號變成電脈沖信號,計算機,信號變成數(shù)據(jù)文件存儲、分析。,流式細胞儀的工作原理,待測細胞被制備成單個細胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在氣體的壓力下進入流動室。流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的約束下，細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，成為細胞液柱。液柱與入射的激光束垂直相交，相交點稱為測量區(qū)。,流式細胞儀的工作原理,通過測量區(qū)的細胞被激發(fā)產(chǎn)生熒光。在與入射光束和液柱垂直的方向放置光學系統(tǒng)（透鏡、光闌、濾片和檢測器等）用以收

6、集熒光信號。圖中的阻斷濾片用于阻擋激發(fā)光，二色性反射鏡用于選擇被測熒光波長，熒光檢測器是光電倍增管（PMT），散射光檢測器是光電二極管，用來收集前向角散射光（FSC）。,細胞分選（cell sorting）的工作原理,液滴形成信號的頻率約30KHz，此信號加在壓電晶體上使之產(chǎn)生同頻的機械振動，流動室也就隨之振動。于是液柱斷裂成一連串均勻的液滴，其形成的速度為每秒3萬個。細胞通過噴嘴的速度大約每秒2000個以下，如以2000個計算則平均每

7、15個液滴中有一個液滴包有細胞，而其他液滴無細胞。細胞的性質(zhì)是在進入液滴以前已經(jīng)被測定了的。,細胞分選（cell sorting）的工作原理,如果其特性與被選定要進行分選的細胞特性相符，則儀器在這個被選定的細胞剛形成液滴時給整個液柱充以指定的電荷。這樣，當被選定的細胞形成液滴時就帶有特定的電荷，未被選定的細胞形成的細胞液滴及不包含細胞的空白液滴不被充電，也不帶電荷。帶有電荷的液滴向下落入指定的收集器內(nèi)，從而完成了細胞分類收集的目的。,流

8、式細胞儀的 分選原理,,流式細胞儀原理示意圖,散射光的測量,在流式細胞術中，從光的散射信號可以得到非常有價值的信息。因為細胞對光的散射是細胞在未遭受任何破壞情況下固有的特性，所以可以用散射光的信號對未染色的活細胞進行分析和分選。,細胞在液流中通過測量區(qū)時，經(jīng)激光照射，細胞向空間360°立體角的所有方向散射光線，散射的信號與細胞的大小、形狀，質(zhì)膜和細胞內(nèi)部的折射率有關。經(jīng)過固定和染色的細胞，因折射率有了變化，故其散射

9、狀況與未固定或未染色的不同。,散射光與細胞參量間的關系與散射角、照射光束的形狀、收集散射光立體角的大小等都有關。在流式細胞術中常被利用的有前向角散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC），前者亦稱0°散射，后者亦稱90°散射。,熒光測量,熒光信號是由對細胞進行染色的特異性熒光染料受激后發(fā)射的。熒光波長與激發(fā)光波長不同且強度較弱，為此就要使用濾片以濾除非熒光信號并使用靈敏的探測器。下面我們將分別進行討論。,熒光測量,激光與普通

10、光線不同；激光是受激輻射，普通光線是自發(fā)輻射。激光基本是沿著直線傳播，發(fā)散角很小，通常在10-6球面度量級的立體角內(nèi)，必要時很容易聚焦到與細胞同一數(shù)量級。激光的亮度高，即在單位面積、單位立體角內(nèi)輸出功率特別大。激光還具有良好的單色性，這些特點都是貢燈所不具備的。,熒光測量,流式細胞術中使用的多為氬離子激光器，亦有用氪離子激光器或染料激光器以獲得不同的譜線者。氬離子激光器是一種氣體激光器，其頻率穩(wěn)定性高、相干性好、壽命長。,熒光測量,氬離

11、子激光器是通過氣體放電使氬離子電離并激發(fā)，實現(xiàn)粒子數(shù)反轉(zhuǎn)而產(chǎn)生激光，譜線共十余條，其中綠光514nm和藍光488nm兩條譜線最強，幾乎占總輸出功率的80%。由于這種激光在氣體放電過程中要使氬離子一次電離必須供給相當大的能量，所以要求有幾百伏和每平方毫米幾個安培的穩(wěn)定電源。,檢測器——光電倍增管和硅光電二極管,對從紫外到可見光的探測，有二類光電器件可供選擇：一類是真空光電器件；另一類是半導體器件。后者在某些方面有一定優(yōu)點，如在強光照射時過

12、載特性較好，但在某些方面則明顯地不及真空光電器件。下面對光電倍增管和硅光電二極管作一簡單的比較。,在200—900nm譜區(qū)光電倍增管有很好的響應，量子效率高，而硅光電管則相當差。光電倍增的時間響應比半導體器件快得多，特殊的光電倍增管上升時間可僅為ns數(shù)量級，而硅光電管在考慮到分布電容和負載時，實際上升時間可能達數(shù)10US。,至于探測器的靈敏閾即探測極限，則與信噪比有關。假定信噪比等于1，用光電倍增管在探測波長為400nm的譜線時，能測得

13、的最小信號功率約為2×10-17w，而硅光電管在波長1060nm處能探測到的最小功率大于2×10-13W，兩者相差四個數(shù)量級。,光電倍增管的增益可從10 3到10 8連續(xù)可調(diào)，而一般硅光電管沒有增益。在光線較弱時光電倍增管有很好的穩(wěn)定性，但是當光線很強時硅光電管就比光電倍增管穩(wěn)定多了，所以在探測FSC時用硅光電管是合適的。由于熒光比SSC較FSC弱得多，這時探測器靈敏度是主要問題，因而應采用光電倍增管。,自發(fā)熒光,未

14、染色的細胞受到光照射后所發(fā)出的熒光稱自發(fā)熒光。用流式細胞計測定細胞的特異性熒光染料的熒光時，這種自發(fā)熒光對所欲測定的特異性熒光是一種本底信號，自發(fā)熒光在多種情況下都會干擾特異性熒光信號，尤其是對低水平結(jié)合的熒光抗體它能減低染色的和未染色的細胞間的區(qū)別，使我們難以確定細胞中熒光信號的水平。,自發(fā)熒光的強弱與細胞的大小、細胞的類型、激發(fā)光的波長、發(fā)射光的檢測范圍等都有關系。產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子可能是正常細胞的組成成分如核黃素、細胞色素等。這些

15、成分在較大的細胞中含量較多，相應的自發(fā)熒光也就強一些。,培養(yǎng)的細胞中死細胞比活細胞的自發(fā)熒光要強，在某些細胞樣品如脾和骨髓中，除了含有淋巴細胞和其他低自發(fā)熒光的細胞外還可能會有一些占不同比例的亮細胞，它們會干擾用免疫熒光方法本應能檢測出來的稀有的、細胞數(shù)目較少的亞群。,為減少自發(fā)熒光，應選用較亮的熒光染料，還應使用與熒光發(fā)射光譜相匹配的光學品質(zhì)優(yōu)良的濾片系統(tǒng)。利用較長波長的光線，如染料激光器的激光做為激發(fā)光源，也可減弱自發(fā)熒光。最后，對

16、自發(fā)熒光還可用電子線路補償?shù)姆椒▽⒆园l(fā)熒光補償?shù)簟?細胞群體的DNA直方圖,流式細胞計測量的結(jié)果可為一數(shù)字矩陣，此矩陣可用一個或數(shù)個圖形來表示。下面我們討論一下，一個細胞群體的DNA直方圖的圖形。,設一個指數(shù)生長的細胞群體全部細胞都處于增殖狀態(tài)，用細胞動力學的語言說，就是增殖比是1。細胞群體經(jīng)染色后,由于每個細胞結(jié)合的染料與DNA含量成正比。由于G1期細胞的DNA含量為2C，G2和M期細胞DNA含量為4C，S期細胞的DNA含量在2C—4

17、C之間。,于是，從理論上說，這樣一個群體的DNA直方圖應該是：即G1期細胞全體都在同一熒光道上63道，G2和M期細胞則位于2*63=126道處，S期細胞位于63—126道之間，由于DNA合成速率不是均一的，因而在這一段范圍內(nèi)不會是均勻分布。,,細胞周期和DNA分布直方圖,,A細胞周期 B DNA直方圖的理論分布C 實際的DNA直方圖,,流式細胞儀的技術指標,1.熒光分辨率 是表明儀器測量所能達到的最大精度，通常用變異系數(shù)表示。顯然它

18、與被其測定的標準樣品有關。 2.熒光靈敏度 以能檢測到最少的FITC分子來表示，即微球上最少標有多少個FITC分子時剛好能被檢測到，即定義為熒光靈敏度。,3．前向角散射光靈敏度 以前向角散射光最小能檢測到的顆粒直徑表示。一般儀器能檢測到的最小的直徑在0.3um左右。4．前向角散射光分辨率 以變異系數(shù)表示。一般約在2.0%。,5．分析/分選速度 分析速度可達每秒5000-10000個細胞，分選速度為每秒5000個細胞通過測量

19、區(qū)。 6. 分選純度 分選純度是個比較復雜的問題，它不但與儀器精度有關，而且與被分選的細胞亞群在整個群體中的相對位置也有關系。如果被分選的亞群在直方圖或二維點圖上可清晰地分辨出來且與其他亞群無重疊，則分選結(jié)果的純度就高，反之就低。,7.分選收獲率 定義為通過測量區(qū)應被分選的細胞如果有100個，實際落到指定收集器中的數(shù)目為95個，此稱為收獲率95%。一般應在90%以上。收獲率與分選純度是呈負相關。 除以上7個參數(shù)外

20、，還有樣品濃度，同時可測參數(shù)、光源、噴孔尺寸、計算機配置等參數(shù)或指標。,細胞的參量和熒光探針,流式細胞術能夠測量細胞的很多參量?？煞譃閮深悾阂活愂莾?nèi)部參量，指不用任何熒光探針標記就可測量的細胞參量；另一類是外部參量，指需要外加熒光探針標記的細胞參量。同時又可將細胞參量分為結(jié)構參量和功能參量，結(jié)構參量描述細胞的形態(tài)特征和化學組成，功能參量描述細胞的理化特征。這被稱為細胞參量的二維分類。,測量細胞的外部參量必須用熒光探針進行標記。熒光探針（

21、熒光染料）是探測細胞內(nèi)結(jié)構的非常靈敏的工具。,常用的熒光素,FITC 異硫氰酸基熒光素 488PE 藻紅蛋白 545PI 碘化丙啶 490EB 溴化乙啶 480AO 丫啶橙 490TRITC 四甲基若丹明 554Texas Red 德州紅

22、 355,參數(shù) 結(jié)構 功能 內(nèi)部 細胞大小、形狀，細胞質(zhì)的顆粒 氧化還原狀態(tài) 性，色素量，蛋白熒光 外部 DNA量、堿基比例， 染色體結(jié)構

23、 膜的完整性，通透性， 酶 RNA量，總蛋白，堿性蛋白 活性，內(nèi)吞性，表面電荷， 表面糖類。 細胞內(nèi)受體，DNA合成， 膜的流動性或微粘度，細

24、 胞質(zhì)/線粒體膜 電位， 膜結(jié)合 的鈣離子，細胞內(nèi)PH,數(shù)據(jù)分析,一、數(shù)據(jù)的顯示 通?？煞忠痪S單參數(shù)直方圖、二維點圖二維等高圖和假三維圖等幾種，以下分別講述。,二維

25、點陣圖,,二維點陣圖分析外周淋巴細胞亞群,二維點陣圖分析外周T細胞淋巴瘤,1．單參數(shù)直方圖 是用得最多的圖形，可用來定性及定量分析。圖中的橫坐標表示熒光信號或散射光信號強度的相對值，單位為“道數(shù)”。直方圖的縱坐標通常代表細胞出現(xiàn)的頻率或相對細胞數(shù)，絕對細胞數(shù)較少使用。,DNA直方圖,,雙參數(shù)點陣圖與直方圖,,2．二維點圖 當需要研究兩個或更多的測量定量關系時，可采用二維點圖的顯示方式。,,二維等高圖 由類似地圖上的等高線組成,

26、,假三維圖 實際上與二維點圖相等，只是用計算機技術將它畫成假三維圖。,,多維數(shù)據(jù)的顯示 目前我們只能依次顯示為，如果數(shù)據(jù)關系較復雜，可用“一調(diào)二”或“二調(diào)一”的技術。,,非參數(shù)分析 常用于單參數(shù)直方圖的定量分析。不使用任何數(shù)學模型，也沒有引入任何變量。也可稱為直觀分析法。,,,DNA直方圖的比較分析,流式細胞術的標本制備,流式細胞術的標本必需制備成單細胞懸液。測定組織標本需用酶消化成單細胞或機械制備。流式細胞術需用新鮮的標本