1、1,第三章 藥物的雜質檢查,§1 藥物的雜質與限量§2 雜質的檢查方法§3 一般雜質的檢查§4 特殊雜質的檢查與鑒定方法,,,,,,,熟悉,了解,掌握,藥物中雜質的來源和分類 雜質限量的概念和計算 一般雜質和特殊雜質檢查方法,藥物中雜質鑒定方法,熱分析法基本原理及在雜質研究中應用,本章學習要求,3,§1 藥物的雜質與限量,4,雜質,任何影響藥品純度的物質均稱為雜質。

2、 雜質無治療作用影響藥物的穩(wěn)定性和療效甚至對人體健康有害。,,一.藥物的雜質與純度,5,藥品純度,藥物的純潔程度, 反映藥品質量的一項重要指標。主要由藥品質量標準中的“檢查”項下的雜質 檢查來控制。,,6,注意,藥物純度的評價,藥物的性狀、理化常數、雜質檢查、含量測定等作為一個有聯系的整體來評價藥物的純度。,,7,二、雜質的來源,雜質的來源,,生產過程,儲藏過程,,合成過程中,原料不純或反應不完全，中間體、副

3、產物在精制中未除盡制劑過程試劑、溶劑、還原劑殘留異構體、多晶體使用的金屬器皿、裝置、工具引入的金屬雜質,8,毒性雜質:對人體有毒害的雜質,如重金屬、砷鹽信號雜質:一般無毒,含量多少反映藥物的純度,如氯化物、硫酸鹽,一般雜質:多種藥物生產或貯存過程中易引入雜質;含量高低與生產工藝水平有關。特殊雜質: 特定藥物生產或貯存過程中引入的, 隨藥物不同而改變,無機雜質:源于生產過程,如反應試劑, 配位體, 催化劑, 重金屬等有機雜

4、質:未反應完全的原料, 中間體, 副產物, 分解物 殘留溶劑:生產中使用有機溶劑,,,,,,,,,,,,,,,,,,,無機有機雜質和殘留溶劑,三.雜質的分類,毒性,來源,一般和特殊雜質,化學類別和特性,,有關物質,四、雜質的限量,定義,藥物中所含雜質的最大允許量。,計算,百分之幾或百萬分之幾（ppm）,表示,注意單位統一！,10,,,雜質限量控制,11,12,例1 茶苯海明中氯化物檢查:取本品0.30g

5、置200ml量 瓶中, …加硝酸銀試液25ml, …取續(xù)濾液25ml置50ml納氏比色管中, …用水稀釋成50ml, …與標準氯化鈉溶液(10μg Cl/ml)1.5ml制成的對照液比較, 求氯化物限量。,13,例2 腎上腺素上酮體的檢查: 取本品0.2g,置100ml量瓶中, …在310nm處測定吸光度不得超過0.05, 酮體的百分吸收系數為435, 求酮體的限量。,14,例3 卡比馬唑片(規(guī)格5 mg)中甲巰咪唑檢查: 取本品2

6、0片, …置10 ml量瓶中, 加…至刻度, …作為供試品;另取甲巰咪唑對照品, …制成100μg/ml溶液, 分別取上述兩溶液各10μl, 展開,顯色。供試液雜質斑點顏色與對照品比較不得更深。求雜質限量。,雜質研究規(guī)范p102,有機雜質在質量 標準中項目名稱檢查項目的確定限度的確定檢查方法的選擇,雜質檢查方法,化學法(顯色,沉 淀,產生氣體, 滴定法)色譜法(TLC, HPLC, GC)光譜法(U

7、V-vis, IR, AAS)熱分析法),§2 雜質的檢查方法,16,腎上腺素中的“酮體”,利巴韋林中“有關物質”,“雜質吸光度”,,一. 雜質研究規(guī)范,17,經研究和穩(wěn)定性考察檢出的, 并在批量生產中 出現的雜質和降解產物。,根據其生產工藝、起始原料情況確定檢查項 目規(guī)定降解產物和毒性雜質的檢查項目,其可能共存的

8、其他對映體應作為雜質檢查,,消旋體藥物,新藥,原料藥和制劑中的雜質,單一對映體藥物,當已有其單一對映體藥物法定質量標準時, 應在該消旋體藥物質量標準中設旋光度檢查項。,2.雜質檢查項目的確定,針對性,18,3.雜質限度的確定,根據每日劑量來制訂質控限度有機雜質的限度規(guī)定應包括：每一個已知雜質、未知 雜質及總雜質。仿制藥品的雜質限度，應與已上市產品進行質量對比 研究。,,藥品安全＋生產可行＋批間波動＋藥品穩(wěn)定性,制訂雜質限

9、度應考慮的因素,19,4. 雜質檢查方法的選擇與驗證,專屬性:根據原料藥或制劑的生產工藝及儲存條件，以中間體、立體異構體、粗品、重結晶母液、經加速破壞性試驗后的樣品作為測試品進行系統適用性研究，考察產品中各雜質峰及主成分峰相互間的分離度是否符合要求。 采用HPLC法檢查有機雜質時,常采用梯度洗脫檢測限: 要符合質量標準中對雜質限度的要求, 最 低檢測限不得大于該雜質的報告限度。,,20,+,→,5-氯-水楊酸,2-氯-4

10、-硝基苯胺,氯硝柳胺,二.雜質檢查方法 1.化學法(顯色反應）,21,雜質：5-氯-水楊酸,紫色配合物,靈敏度法檢查,對照法檢查,鹽酸萘乙二胺,,,,,23,2.沉淀反應:鹽酸肼屈嗪中游離肼檢查,肼與芳醛產生腙沉淀,24,3. 生成氣體:NH34. 滴定法:如硫酸亞鐵中高鐵鹽檢查,25,2.色譜法:有關物質檢查首選方法,TLC法:許多國家藥典用于藥物雜質檢查(p105-107)雜質對照供試品溶液自身稀釋對照雜質對照品與供試品溶

11、液自身稀釋對照并用對照藥物,26,已知雜質并能制備雜質對照品供試品溶液; 一定濃度雜質對照品溶液;分別點樣于同一硅膠薄層板上， 展開、定位;比較、判斷；確證色譜系統分離效能:雜質對照 液與供試液成混合對照溶液。,⑴雜質對照品法,供試液(10 mg/mL), 氟喹啉酸(30μg/mL), 混合對照液(1:1)各5μL, 點樣, 展開混合對照液: 環(huán)丙沙星與氟喹啉酸完全分離供試品中雜質斑點

12、≯相應雜質對照斑點(0.3%),例 鹽酸環(huán)丙沙星中氟喹啉酸檢查,28,⑵供試液自身稀釋對照法,雜質結構不確定或無雜質對照品供試液按限量要求稀釋至一定濃度 作為對照液供試液和對照液分別點樣、展開、定位供試液所顯雜質斑點≯對照液所顯主斑點,29,,,如：吡羅昔康中有關物質的檢查,供試液:20mg/mL對照液: 0.2mg/mL供試液與對照液點于同一薄層板;判斷:供試品溶液雜質斑點顏色≯對 照液主斑點顏色,,稀釋 1

13、00倍,30,⑶雜質對照品與供試品溶液自身稀釋對照并用,雜質有對照品:雜質對照法檢查；未知雜質或無對照雜質:供試液自身稀釋對照法檢查,31,,供試品溶液: 20mg/ml 對照溶液: 0.10 mg/ml 對照品溶液:3-甲基黃酮-8-羧酸 0.10 mg/ml判斷:供試品溶液雜質斑點≯2個與對照品溶液相同的位置上所顯雜質斑點的顏色≯對照品溶液主斑點，另一雜質顏色≯對照

14、溶液主斑點。,例 鹽酸黃酮哌酯中有關物質的檢查,,,稀釋,,,32,無合適雜質對照品或供試品顯示的雜質斑點顏色與主成分斑點顏色有差異與供試品相同藥物作對照品。對照藥物中所含待檢雜質符合限量要求,⑷對照藥物法,供試液1: 5mg/ml; 供試液2: 0.2mg/ml; 對照品(藥物): 5mg/ml點樣10μl; 展開、檢視；供試液1與對照液主斑點相同; 供試液1雜質斑點顏色≯對照液對應雜質斑點顏色供試液2只顯主斑

15、點,例 馬來酸麥角新堿中有關物質檢查,34,該方法僅能定性或半定量薄層掃描法:定量分析,具有分離效能高、快速、簡便等特點,精密度和準確度不如HPLC法高,作為HPLC補充,用于無紫外吸收或不能用HPLC法分析的組分檢查,35,限量要求：規(guī)定雜質斑點數和單一 雜質量、雜質總量,,36,HPLC法,外標法(雜質對照品法)加校正因子的主成分自身對照法不加校正因子的主成分自身對照法面積歸一化法,(p108-110),37,⑴外標法(雜

16、質對照品法),38,例 卡托普利及其片劑中卡托普利二硫化物檢查,供試品溶液: 0.5 mg/ml對照品溶液:卡托普利二硫化物對照品, 5 μg/ml混合溶液:卡托普利和卡托普利二硫化物對照品 0.1mg/ml和15 μg/ml適用性試驗:混合溶液; R > 4.0原料藥: 二硫化物含量≯1.0%, 片劑: 二硫化物含量≯3.0%卡托普利標示量,,39,⑵加校正因子的主成分

17、自身對照法,AS,CS:藥物對照品峰面積和濃度；AR,CR:雜質對照品峰面積和濃度；,AS’, CS’:對照液(供試品稀釋液) 藥物峰面積和濃度；AX,CX:供試液中雜質峰面積和濃度,適用于已知雜質控制,雜質校正因子,消除雜質與主成分的響應因子可能不同所引起的測定誤差,40,例 紅霉素A中紅霉素B、C組分及有關物質檢查,,稀釋,,供試品溶液: 4mg/ml 對照溶液: (0.2mg/ml)

18、 調靈敏度: 對照溶液, h主約為滿量程的 20% 進樣: 供試品溶液; 對照溶液 分析時間: 4t主 f紅霉素A 1.0; f紅霉素B 0.7; f紅霉素C 1.0; f紅霉素烯醇醚 0.09 判斷： A紅霉素B校正、 A紅霉素C校正<A紅霉素A對照液 A紅霉素烯醇醚校正≤0.6A紅霉素A對照液; 其他∑Ai≯A紅霉素A對照液,41,⑶不加校正因子的主成分自身對照法,AS, CS: 對照液(供試

19、品稀釋液) 藥物峰面積和濃度；AX,CX: 供試液中雜質峰面積和 濃度；,適用于無雜質對照品,42,供試品溶液: 0.4mg/ml 對照溶液: (0.4 μg/ml) 調靈敏度: 對照溶液, h主約為 滿量程的 25% 進樣: 供試品溶液; 對照溶液 分析時間: 2t主 判斷: Ai ≯ 0.25A對(0.25%), ∑Ai≯ A對

20、（1.0%）。,,例 利巴韋林中有關物質的檢查,稀釋,,43,⑷面積歸一化法,適用于供試品中結構相似, 相對含量較高且限度范圍較寬的雜質含量粗略考查計算各雜質峰面積占總峰面積百分率,44,GC 常受到樣品揮發(fā)性的限制;對于揮發(fā)性差或熱不穩(wěn)定的化合物, 雖然可以采取柱前衍生化試劑制備成衍生物或采用裂解、水解、硅烷化等方法預處理以增加其揮發(fā)性, 但畢竟增加了操作上的麻煩, 改變了原來樣品的面目, 而且不易復原。GC 僅用于檢查揮發(fā)性雜

21、質和藥物在生產過程中引入的有害有機溶劑殘留量,,45,GC法,揮發(fā)性雜質; 殘留溶劑的檢查同HPLC法標準溶液加入法: 精密加雜質對照液到供試液中, 測雜質含量, 扣除加入的對照液含量, 得供試液中雜質含量,46,CE:快速、高效、進樣量小、分離模式多。目前受自身靈敏度和重復性的限制, 在藥物雜質研究中的應用不普遍。超高效液相色譜法(UPLC , 粒徑105 kPa) 能顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度, 大大縮短分析時間, 適

22、用于微量復雜混合物的分離和高通量研究。LC-MS 法對色譜峰進行峰純度檢查, 以驗證分析方法的可靠性; 通過高分辨質譜提供的元素組成信息和LC-MS-MS法提供的碎片離子信息推斷雜質結構LC-NMR:用于藥物中雜質、藥物代謝的產物以及手性藥物的分析等,47,,藥物和雜質紫外特征吸收 差異；地蒽酚中二羥基蒽醌檢查 二羥基蒽醌:λmax432nm； 地蒽酚:該波長下無吸收。,3.光譜法(UV),二羥基蒽醌的,規(guī)定：A432

23、≯0.12； 雜質限量≤2.0%。,49,藥物中無效或低效晶形的檢查 晶形結構不同，鍵長、鍵角發(fā)生不同程度變化 某些特征峰的頻率、峰形和強度差異。,IR,50,氯化物（硫酸鹽、鐵鹽）檢查 重金屬檢查 砷鹽檢查 干燥失重 熾灼殘渣 殘留溶劑,§3 一般雜質檢查方法,p118-129,51,1. 原理

24、 （白色渾濁） 與一定量標準NaCl液同條件下產生的AgCl比較渾濁程度;標準氯化鈉溶液濃度:10?gCl/mL,一. 氯化物檢查法,2.方法,樣品管,對照管,,53,,3. 注意 平行試驗反應最佳條件 硝酸酸性 氯化物范圍: 50 mL供試液含Cl 50～80μg 觀察比較 襯于黑色背景自上而下觀察； 暗處放置5

25、min。,54,二、硫酸鹽檢查法,標準：100μg SO42-/ml,紅色,標準：10μgFe/ml,三、鐵鹽檢查法（硫氰酸鐵法）,55,四、重金屬檢查法 (Pb),實驗條件（溶液pH）下, 與硫代乙酰胺或硫化鈉 作用呈色的金屬。 檢查重金屬時以Pb為代表,56,1. 硫代乙酰胺法,,條件 介質：醋酸鹽緩沖液 (pH 3.5) 試劑：CH3CSNH2 雜質對照液：Pb(NO3)2 (10µg/ml

26、) 靈敏度范圍： 10~20 ?g/ 27ml,黃色至棕黑色混懸液,原理:,57,2. 熾灼后的硫代乙酰胺法,58,3. 硫化鈉法,59,,,,五.砷鹽檢查法（古蔡氏法）,原理：Zn與酸產生新生態(tài)氫，與藥物中微量砷鹽生成 揮發(fā)性AsH3，遇HgBr2試紙產生黃色至棕色砷斑,,60,方法：古蔡氏法檢砷器,8cm,,,有孔玻璃旋塞,導氣管,AsH3發(fā)生瓶,,,,,溴化汞試紙,,醋酸鉛棉花(60mg),,HCl Zn 粒碘

27、化鉀試液酸性氯化亞錫試液,生成砷斑,吸收硫化氫氣體,61,討論標準砷溶液: As2O3配制貯備液，臨用前稀釋成1μgAs/mL酸性SnCl2: As5+→As3+,62,KI作用： As 5+→As 3+ ，KI→I2→I－,,Zn2+不斷被消耗使生成AsH3的反應向右進行。,63,PbAc2棉花作用：排除硫化物干擾。 樣品或Zn粒中含硫化物時，酸性溶液中產生 H2S 氣體能與HgBr2試紙作用產生色斑。 H2S與

28、PbAc2反應生成PbS沉淀留在棉花上,64,二乙基二硫代氨基甲酸銀法[Ag(DDC)法],,紅色膠態(tài)銀,,,目視比色法,510nm 測定A值,65,,,線性范圍：1～10μg/40ml含銻藥物不干擾測定用于砷鹽的限量檢查和微量 砷鹽的含量測定,66,干燥失重: 規(guī)定條件下，藥品經干燥減失量(%) 檢查藥物中水分及其他揮發(fā)性物質。 恒重:供試品連續(xù)兩次干燥或熾灼后稱重差異 ≤0.3 mg,六、干燥失

29、重法,67,測定方法,68,有機藥物經炭化或揮發(fā)性無機藥物加熱分解后，高溫熾灼所產生的非揮發(fā)性無機雜質的硫酸鹽。,,0.1%～0.2%,七、熾灼殘渣,69,殘留溶劑：在合成原料藥，輔料或制劑生產的過程中使用的，但在工藝中未能完全除去的有機溶劑。 填充柱檢查方法：GC法 毛細管柱檢測

30、器：FID ECD ：含鹵素殘留溶劑,,八、殘留溶劑法,70,藥品中常用殘留溶劑,71,用待測物色譜峰計算，填充柱n>1000；毛細管柱 n>5000 待測物與鄰峰R>1.5； 內標法：對照液進樣5次，所得待測物與內標物峰 面積之比的RSD≯5%； 外標法：所得待測物峰面積的RSD≯10%,系統適用性試驗,72,測定方法,頂空進樣： 樣品溶液于密閉

31、容器中， 一定溫度下加熱一段時 間， 氣液達平衡， 取氣相部分進行GC， 測定樣品上方蒸氣中組分 在原樣品中含量 免去樣品萃取、濃集等， 避免供試品中非揮發(fā)組分對 色譜柱的污染,74,頂空平衡時間30～60min; 平衡溫度低于溶解供試品所用溶劑沸點10℃以下水溶性藥物：水為溶劑； 非水溶性藥物：二甲亞砜(DMSO), N,N-二甲基甲酰胺(DMF)對照液和供試液的基質差異用標

32、準加入法消除,75,76,特殊雜質研究規(guī)范特殊雜質鑒定合成雜質對照品法色譜制備雜質對照品法,§4 特殊雜質檢查與鑒定方法,77,超過鑒定限度的雜質:確定來源,推測可能結構, 判斷該雜質對藥物安全性的影響;穩(wěn)定性研究中產生的超過鑒定限度的降解產物也應做相應的結構鑒定。有關物質的定性研究:獲得有關物質結構信息; 其形成過程的分析:設法避免該雜質產生,或經純化使之含量降至最低。,《化學藥物雜質研究的技術指導原則》2005

33、年,78,藥物中有關物質結構研究的步驟,采用不同分離機制的色譜分離方法檢測有關物質, 結合合成、制備路線與MS的檢測推測有關物質的可能結構, 然后取可能存在的雜質(如合成過程中的原料、中間體等)與含雜質的藥物進樣, 在相同的色譜條件下考查已知化合物與該雜質的保留時間是否一致; 也可將已知化合物加入含雜質的藥物中, 考查擬確定的雜質峰面積是否有變化。利用DAD, 觀察擬定性的有關物質的紫外吸收, 或與已知化合物的紫外吸收光譜進行對比,

34、分析該雜質結構中可能存在的官能團。,79,采用GC-MS 或LC-MS-MS聯用技術, 為有關物質的結構確定提供相關信息; 或利用LC-IR和LC-NMR等聯用技術, 在不分離雜質的情況下在線獲得雜質的IR 和NMR 圖譜; 或利用制備型色譜獲得有關物質的樣品, 然后通過IR、MS、NMR 的檢測, 確定有關物質的結構。合成已知結構的有關物質, 并與藥物雜質的色譜數據和光譜信息進行對照, 以確定有關物質, 并建立其定量測定方法。,80

35、,特殊雜質研究規(guī)范,定性或結構確證表觀含量≥0.1%雜質<0.1%強烈生物作用雜質或毒性雜質,81,特殊雜質鑒定,合成雜質對照品法雜質量較小，分離純化困難比較色譜性質、UV特征和MS鹽酸非索非那定中雜質鑒定:長期留樣雜質2增加1.53%, 采用LC-MS鑒定,82,83,84,中間體水解得雜質2，HPLC測定合成的雜質2，與留樣中雜質2 比較tR,85,86,色譜制備雜質對照品法雜質量較大，分離雜質元素分析，UV、I

36、R、NMR和MS確證炎琥寧有關物質結構鑒定有關物質檢查雜質1制備雜質1結構鑒定,87,有關物質檢查,88,雜質1制備,制備色譜制備；分段收集含雜質流出液；流出液用乙酸乙酯萃取，水浴旋蒸揮干即得,89,雜質1結構鑒定,炎琥寧和雜質1單體UV、IR、NMR和LC-MS,90,UV,炎琥寧λmax 251nm雜質1λmax 264nm: C15形成羧基，共軛體系增長,91,IR,雜質1：內酯環(huán)開環(huán)，形成兩個羧基νOH 344

37、4 cm-1;νCH 2927 cm-1;νCH 2854 cm-1νC=O 1719 cm-1;νC=C 1614 cm-1νC-O 1407 cm-1;νC-O-C 1165 cm-1,92,NMR,雜質1 13C-NMR：6 個δC=O (C15,C16,C1’, C4’,C1’’, C4’’), 比炎琥寧多1個, 即C15 形成羧基, δ 70.4 →δ 166.4; 1H-NMR：低場活潑氫(羧基氫)4 個, 是PS

38、DS 兩倍 雜質1 與炎琥寧母核一致6 個烯碳 (C8, C11,C12, C13, C14, C17), 2 個CH3 (C18, C20), 3 組單質子烯氫 (δ 6.25, 5.98, 5.79),,93,LC-MS,LC-ESI/TOFMS ：炎琥寧和雜質1分子量分別532.23100與564.22216;LC-ESI/MSn(雜質1) : MS1 ：m/z 587.2 [M+Na]+; MS2