1、卵母細胞體外成熟的機制與臨床應用,主講人：鄭月慧南昌大學江西醫(yī)學院2017年7月8日,一、卵母細胞體外成熟的定義、應用及其發(fā)展現(xiàn)狀二、卵母細胞體外成熟的機理及其調(diào)控三、卵母細胞體外成熟技術的優(yōu)化和臨床應用評估,我將從以下三個方面陳訴：,一、卵母細胞體外成熟的定義、應用及其發(fā)展現(xiàn)狀,卵母細胞的體外成熟技術(IVM)是一項輔助生殖技術，簡單地講就是，將卵巢小卵泡中的未成熟卵子取出，放在模擬體內(nèi)卵泡微環(huán)境的培養(yǎng)液中進行體外培養(yǎng)到成熟階

2、段，排出第一極體，再進行體外授精技術幫助受精，體外受精過程與體內(nèi)成熟的卵子大同小異。,1、什么是卵母細胞的體外成熟技術？,,第一步：取出未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)至成熟,,第三步： 胚胎移植,IVM Treatment,第二步：體外受精,一、卵母細胞體外成熟的定義、應用及其發(fā)展現(xiàn)狀,2、未成熟卵體外成熟技術的應用及其發(fā)展 上世紀九十年代，試管嬰兒之父——愛德華茲先生就把卵母細胞體外成熟技術（IVM），作為輔助生殖技術未

3、來發(fā)展的三大前景技術之一，其它兩個技術是微刺激和自然周期試管嬰兒技術。 近十余年來，IVM技術遍布全世界，對于一種不用或減少卵巢刺激，提高患者舒適度的治療理念，人們一直在努力嘗試更好的體外培養(yǎng)條件，以獲得更高的成功率,目前應用,,卵巢多囊綜合征（PCOS）患者,卵巢高度反應有卵巢過度刺激綜合征（OHSS）病史,卵巢不適于藥物刺激而本身又沒有成熟卵泡生長,對自然周期IVF治療同時取出其余小卵泡（IVF/IVM）,一、卵母

4、細胞體外成熟的定義、應用及其發(fā)展現(xiàn)狀,3、體外成熟技術安全嗎？ 這同樣也是我們醫(yī)護人員們最為關心的問題。 IVM出生的孩子遍布世界各地，目前全世界大概有5000～10000名體外成熟卵試管嬰兒健康成長。其妊娠率可達到與體內(nèi)成熟卵相當（35～50%）。結果表明，較其他輔助生殖技術，IVM技術并沒有增加子代異常的風險 但是，畢竟卵母細胞體外成熟技術，將使卵子暴露于體外條件更長時間，理論上增加了卵子受培養(yǎng)環(huán)

5、境影響的風險，在基因編程、表觀遺傳學、倫理學等方面，還需要更加深入的研究和探索。因此目前該技術只是適用于特殊人群，還沒有普及到每一例試管嬰兒,二、卵母細胞體外成熟的機理及其調(diào)控,與自然狀態(tài)下和傳統(tǒng)的IVF等輔助生殖技術中卵母細胞成熟方式不同，IVM未成熟卵母細胞的減數(shù)分裂在體外完成，該過程受如下多種因素影響： 1、取卵方式與時間 2、體外培養(yǎng)方法 3、IVM實施方案,卵母細胞體外成熟,? 取卵方式與時間,? 體

6、外培養(yǎng)方法,? 培養(yǎng)液添加成分,,,,1、取卵方式與時間IVM取卵方式：?直接從陰道采集 ?從手術切除的體外卵巢組織上采集,IVM的卵母細胞恢復能力受陰道采集時抽吸壓力和針頭型號的影響：較高吸取壓力（大約為56 mm Hg）和較粗針頭有利于卵母細胞恢復。有文獻報道，將卵母細胞采集針反復在卵巢基質上抽吸的過程中逐漸增加抽吸壓力，可采集到更多卵泡。,IVM取卵時間：,由于未成熟卵母細胞主要來源于小卵泡，所以取卵技術略不同于含有

7、成熟卵子的大卵泡。取卵難度相對大一些，因為卵巢游動度較大，患者容易產(chǎn)生不適，所以一般都在麻醉下完成取卵。一般每個患者大約可以取到7～30余個不成熟卵子。卵泡越小，卵母細胞恢復減數(shù)分裂進而發(fā)育成熟的能力越弱，但體積較大的優(yōu)勢卵泡可分泌大量雌激素而引起周圍卵泡閉鎖。因此，過早或過晚結束培養(yǎng)都會對卵母細胞的質量產(chǎn)生不利影響。目前，一般在卵泡直徑達到10～12 mm時結束培養(yǎng),100um,2、體外培養(yǎng)方法,體外培養(yǎng)方法可分為如下幾類：,3、

8、IVM實施方案根據(jù)Gn使用情況，將IVM實施方案大致分為以下幾種：,一般來講，未成熟卵子需要在體外培養(yǎng)24～48小時，國際報道的成熟率可以達到60～75%。這些體外成熟卵子可以體外受精發(fā)育成胚胎，進行宮腔移植。,三、卵母細胞體外成熟技術的優(yōu)化和臨床應用評估,（圖：胚胎發(fā)育的不同階段）,1、卵母細胞體外成熟技術的優(yōu)化?培養(yǎng)液的優(yōu)化：將未成熟的小竇狀卵泡從人體內(nèi)取出后，卵母細胞所處環(huán)境即發(fā)生變化，與其直接接觸的培養(yǎng)液成分將對卵母細胞

9、的發(fā)育、成熟、受精能力等產(chǎn)生重要的影響。,三、卵母細胞體外成熟技術的優(yōu)化和臨床應用評估,三、卵母細胞體外成熟技術的優(yōu)化和臨床應用評估1、卵母細胞體外成熟技術的優(yōu)化,體外成熟卵子的體外授精：既可采用常規(guī)體外授精技術完成受精，或用單精子卵胞漿內(nèi)注射（ICSI）技術授精。為了提高受精率，卵子體外成熟后一般建議選擇ICSI授精方式。,?授精方式的優(yōu)化：,單精子顯微注射流程圖,三、卵母細胞體外成熟技術的優(yōu)化和臨床應用評估1、卵母細胞體外成熟

10、技術的優(yōu)化,?胚胎移植前的優(yōu)化：,移植前胚胎的輔助孵出（AH）：就是采用激光在胚胎的透明帶上產(chǎn)生一個薄弱點，輔助囊胚易于孵出著床。因為卵子體外成熟的培養(yǎng)時間較長，理論上卵子的透明帶結構可能比較厚硬，為了提高著床率，移植前往往建議進行胚胎的輔助孵出。,,,三、卵母細胞體外成熟技術的優(yōu)化和臨床應用評估2、卵母細胞體外成熟技術的臨床應用評估,由于卵泡未成熟體積小，取卵需要特定裝備與高超技術，培養(yǎng)技術也非同一般，體外受精則必需顯微操作,術前

11、不需要應用昂貴藥物刺激，可以避免藥物治療副作用，大大減少費用且降低本病常見的促排卵引起的卵巢過度刺激綜合征風險,優(yōu)點,缺點,,,謝謝大家！,一、Ghrelin對卵母細胞成熟的影響,1 Ghrelin的結構及其分布2 Ghrelin受體的信號通路及其分布3 Ghrelin對卵母細胞成熟的影響,? Ghrelin的結構哺乳動物中，Ghrelin被發(fā)現(xiàn)是一種協(xié)調(diào)能量和生殖活動平衡的促進食欲的胃腸激素，是生長激素促分泌物受體（Growth

12、 hormone secretagogue receptor，GHS-R ）的內(nèi)源性配體,Ghrelin是28個氨基酸組成的肽，其第三個絲氨酸是N端?；?，這是ghrelin活性所必需的。大鼠和人類的Ghrelin只有兩個氨基酸殘基的差異,圖1 調(diào)節(jié)垂體生長激素釋放（引自Kojima M and Kangawa K,2005),圖2 人和大鼠Ghrelin的結構（引自Kojima M and Kangawa K,2005),

13、1 Ghrelin的結構及其分布,Ghrelin,影響食物攝入、睡眠和行為,調(diào)節(jié)細胞增殖分化,影響心臟功能與血管阻力,影響能量代謝和糖代謝,影響胃酸分泌與胃運動,影響胰腺外分泌和內(nèi)分泌功能,刺激GH、ATCH、PRL的分泌,2 Ghrelin的結構及其分布,影響生殖功能,,,,,,,,,2 Ghrelin受體的信號通路及其分布,Ghrelin受體（GHS-R）是典型的七次跨膜G蛋白偶聯(lián)體，受體有7次跨膜的α螺旋區(qū)和3個細胞內(nèi)和外的氨基

14、酸環(huán),?GHS-R和GHRH引起GH釋放的信號通路（引自 Teresa Lorenzi et al.）,絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI-3激酶是主要參與激活核轉錄因子以控制細胞增殖，分化和凋亡的絲氨酸/蘇氨酸激酶,?ghrelin作用ERK1/2和PI-3激酶信號通路（引自 Choi K et al.）,3 Ghrelin對卵母細胞成熟的影響,? 體外成熟過程中卵母胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA相對表達量隨著成熟進

15、程顯著下降,? Ghrelin蛋白在牛卵母細胞胞質中表達，而GHS-R蛋白則特異性的定位于卵母細胞膜表面，在卵丘細胞中均有Ghrelin和GHS-R蛋白表達。,? FSH抑制卵母細胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA表達，而FSH顯著促進卵丘細胞Ghrelin和GHS-R1a mRNA表達；FSHBI解除FSH對卵母細胞Ghrelin和GHS-R1a m RNA表達的抑制作用和FSH對卵丘細胞Ghrelin和GHS-R1a m

16、 RNA表達的促進作用,二、褪黑素對卵母細胞成熟的影響,1褪黑素的結構及其分布2褪黑素受體及其信號通路3 褪黑素Ghrelin對卵母細胞成熟的影響,,1 褪黑素的結構及其分布,褪黑素（Melatonin, MT），化學結構為乙?；籽趸罚肿恿繛?，是首先在松果體中發(fā)現(xiàn)的一種胺類物質，褪黑素合成前體是色氣酸,主要用途,抗擊腫瘤,改善睡眠,調(diào)節(jié)免疫,延緩衰老,,2褪黑素受體及其信號通路,MT1和MT2褪黑素受體信號通路：A:褪黑

17、素和MT1受體結合后激活兩條通路，通過Gq偶聯(lián)受體α-亞單位抑制cAMP的合成及通過βr亞單位增強憐酸肌醇的分解。B：MT2褪黑素和結合后的信號通路。,3 褪黑素對卵母細胞成熟的影響,褪黑素具有抗氧化活性，褪黑素能通過多條途徑降低氧化應激，是一種高效的自由基清除劑。,圖為褪黑素在卵泡中的作用示意圖。褪黑素可以調(diào)控卵泡壁細胞和顆粒細胞固醇類合成酶的表達而影響類固醇激素的分泌。褪黑素同時可以調(diào)控LHmRNA的表達，Bcl2和Casp3的

18、生成，IGF和TGF-β的活性和成熟透導激素的活性。褪黑素能調(diào)節(jié)顆粒細胞SOD、Gpx和CAT的表達。過多ROS的會引起凋亡和卵泡閉鎖，而卵泡內(nèi)的視黑素可以直接或間接清除ROS而抑制卵泡閉鎖，從而使卵泡繼續(xù)發(fā)育為優(yōu)勢卵泡。,三、白藜蘆醇對卵母細胞成熟的影響,1 白藜蘆醇的結構及其性質2 白藜蘆醇作用相關信號通路及其分布3 白藜蘆醇對卵母細胞成熟的影響,白黎蘆醇（Resveratrol，RES)是一類多齡類化合物，存在于紅色葡萄皮、紅

19、酒或其他的植物提取物中。,1 白藜蘆醇的結構及其性質,分子式,相關保健品,2 白藜蘆醇作用相關信號通路,在哺乳動物中白黎蘆醇是SIRT 1的激活劑，能夠保護線粒體的功能，除此之外，還具有抗氧化、抗衰老等生物學作用,白藜蘆醇,減少臟器纖維化,促進臟器結構功能恢復,恢復氧化應激穩(wěn)態(tài),恢復能量代謝穩(wěn)態(tài),3 白藜蘆醇對卵母細胞成熟的影響,? 白黎蘆醇能夠提高女性GV期卵母細胞的成熟；? 白黎蘆醇能改善卵母細胞線粒體的功能；? 白