1、一、動物人工繁殖 包括有性生殖和無性生殖兩條途徑。前者的關鍵技術(shù)是人工受精與體外受精，后者的關鍵技術(shù)是核移植，兩者都涉及胚胎培養(yǎng)與移植。胚胎工程是通過在生殖細胞、胚胎細胞水平上的顯微操作技術(shù)，來定向控制、改造和創(chuàng)造新遺傳性狀的技術(shù)，是動物細胞工程的拓展和延伸。又稱發(fā)育工程（revelopmental technology）。,第六章、動物人工繁殖,二、發(fā)展歷史及意義 發(fā)展歷史 胚胎移植技術(shù)是胚胎工程的

2、基礎。 1891年，英國人希普首次在兔子身上成功的進行了核移植。 20世紀30年代，陸續(xù)在鼠、兔、羊、豬、牛和馬進行胚胎移植實驗，相繼獲得成功。 20世紀60年代以來，隨著胚胎移植技術(shù)的不斷成熟和規(guī)范化，以及一系列新方法的建立，胚胎工程進展迅速，以日本、澳大利亞和加拿大發(fā)展最快。 1987年，美國用家貓做代理母親，移植了一只瀕臨滅絕的珍貴貓的受精卵，成功獲得試管貓。 我國自20世紀70年代開始發(fā)展

3、該技術(shù)，進展也較迅速，但與世界先進國家相比，還存在較大差距。 1977年，英國科學家首次創(chuàng)造了世界上第一個試管嬰兒。,意 義 1 發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖能力 胚胎移植技術(shù)是提高母畜繁殖潛力的有效方法，擴大良種雌性配子的推廣利用。（超數(shù)排卵、同步發(fā)情） 2 促進家畜改良的速度（泌乳高的奶牛、瘦肉型豬、毛肉兼用的細毛羊等） 3 作為胚胎操作的基礎（卵子切割、性別控制、嵌合體制作、細胞

4、核移植、轉(zhuǎn)基因操作等） 4 保存遺傳資源 胚胎超低溫冷凍技術(shù)的運用，給長期保存和運輸、異地移植帶來方便，還可用于建立“胚胎庫”等。,三、胚胎工程,2 卵子回收及成熟培養(yǎng),1 精子的采集及體外獲能 精子獲能分為體內(nèi)獲能與體外獲能 體外獲能：第一步離心，第二步洗滌改變膜的滲透性,3 卵子和精子的體外受精（in vitro fertilization IVF） 受精成功的標志至少是看受精卵是否可以發(fā)育至囊胚期

5、階段,4 受精卵的體外發(fā)育及體外培養(yǎng),（一）、人工受精,指從某個體采胚或?qū)⒃嚬軆?nèi)的受精卵（8細胞以上或囊胚期）移植到另一個體的輸卵管或子宮中去的技術(shù)。 提供胚胎或受精卵的母畜稱為“供體”。 接受胚胎或受精卵的母畜稱為“受體”，又稱“代孕母體”或“代理母親”。 來自供體的胚胎能夠在受體的子宮著床，并繼續(xù)生長和發(fā)育，最后產(chǎn)下供體的后代，即是所謂的“借腹懷胎”。,（二）、 胚胎移植（embryo transfer，E

6、T）,1 胚胎移植的最佳時期 體外培養(yǎng)受精卵發(fā)育至8細胞以上的胚胎（囊胚期）時是胚胎移植的最佳時期。早期胚胎發(fā)育的三個階段： 1）桑椹胚 卵裂球分裂到16-32細胞時，成為一緊密的細胞團，稱為桑椹胚。在2-8個細胞時，每個細胞均具有全能性。 2）囊胚 在胚胎內(nèi)形成空腔，逐漸變大成為囊胚腔，此時一端細胞個體較大，形成密集（三層）的內(nèi)細胞團（ICM），將來發(fā)育成胚體。另一端只有環(huán)透明帶一層細胞，稱滋養(yǎng)層，將來發(fā)

7、育成胚膜。 3）原腸胚 囊胚進一步發(fā)育，內(nèi)細胞團外的滋養(yǎng)層退化，內(nèi)細胞團裸出形成胚盤，在胚盤下方衍生出內(nèi)胚層，此時胚胎稱原腸胚。,(圖),（圖）,（圖）,下頁,,,返回,,,返回,,,返回,2 超數(shù)排卵 在母畜發(fā)情周期的適當時間用人工方法促使其有更多的卵泡發(fā)育、成熟、排卵的一項技術(shù)。 方法是注射促性腺激素，如孕酮、雌二醇、促卵泡激素、促黃體激素、促性腺激素釋放激素等。3 同步發(fā)情 指使供體和受體同步發(fā)

8、情，即處于相同的生殖周期。4 人工受精和胚胎的采集、鑒別 超排卵處理的母體在停藥后24-48小時開始發(fā)情，此時可進行人工受精，以后約在3-7天從母體采集受精卵或胚胎。正常發(fā)育的胚胎，其中細胞(卵裂球)外形整齊，大小一致，分布均勻，外膜完整。無卵裂現(xiàn)象(未受精)和異常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。5 胚胎移植 外科手術(shù)法或非手術(shù)法,下頁,胚胎采集：,1. 手術(shù)法,2. 非手術(shù)法,,返回,（三）胚胎分割

9、 采用顯微操作技術(shù)，將早期胚胎切割成多份，再移植給受體母畜，達到實現(xiàn)同卵多胎后代的目的。（四）胚胎融合 又稱胚胎嵌合。將兩枚或兩枚以上的胚胎（同種或異種）的部分或全部細胞融合在一起，使之發(fā)育成一個胚胎，然后移植到受體母畜體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育形成一種嵌合體后代的技術(shù)。,（五）動物性別控制與胚胎性別鑒定 性別控制 通過人為干預或操作手段使母畜繁殖所需要的某一性別的后代。 性別控制主要用于家畜，可通過兩條途徑：即X

10、與Y精子的分離技術(shù)和胚胎性別鑒定。 1） X與Y精子的分離技術(shù) 包括免疫學分離法和流式細胞分離法。前者是利用Y精子上存在雄性特異性組織相容性抗原（H-Y抗原）,利用H-Y抗體進行檢測分選。后者是根據(jù)X精子和Y精子中DNA含量的差異，在流式細胞儀上分選。,2） 胚胎性別鑒定 指利用細胞生物學或分子生物學的方法識別胚體性狀，有效控制動物后代性別比例的技術(shù)。 細胞生物學方法：通過核型分析對胚體進行

11、性別鑒定 分子生物學方法：通過PCR擴增Y染色體上性別決定區(qū)的Y基因（SRY）來進行胚體性別鑒定。 另外，可以通過激活卵母細胞實現(xiàn)孤雌生殖以及克隆技術(shù)實現(xiàn)家畜的性別控制。,（六）胚胎冷凍保存技術(shù) 這是在冷凍細胞的基礎上發(fā)展起來的，包括精子、卵母細胞和早期胚體的冷凍保存，在此只介紹胚胎的保存。 短期臨時保存：指將暫時不使用的胚胎在37℃培養(yǎng)液中保存，或在活體同種或異種動物的輸卵管內(nèi)保存1-2天。也可將胚胎置

12、0-4℃低溫下保存2-3天。 長期冷凍保存：有儀器程序逐步降溫冷凍和徒手操作的快速玻璃化冷凍。前者利用冷凍儀按編程由室溫逐步降溫至零下196℃（液氮）保存。所用冷凍劑一般為二甲基亞砜、氨基酸、甘油等。后者是直接加入高濃度的抗凍液（玻璃化冷凍保護液）急速冷凍，有液體轉(zhuǎn)化為透明膠狀固體。 胚胎冷凍技術(shù)首次成功是1971年在小鼠進行的，至今該技術(shù)已逐漸完善，世界各國已相繼建立起許多動物，包括人的精液庫和胚胎庫等，在這方面已形成

13、一門獨立的學科——冷凍生物學或低溫生物學。,科學時報2004年9月28日報道：9月23日，全球首位成功進行自體卵巢再移植并自然受孕的女性，32歲的比利時婦女陶拉特順利分娩出一個女嬰。 1997年，25歲的陶拉特因患淋巴癌需接受化療和放療，為保證今后的正常生育能力，醫(yī)療組將其卵巢組織取出，在零下196度的液氮中冷凍保存起來。6年后（2003年2月）陶拉特癌癥治愈，將其冷凍卵巢移植回她的體內(nèi)，4個月后恢復排卵功能，不久成功自然受孕。

14、 這種冷凍卵巢技術(shù)是源于早期的卵子冷凍技術(shù)。迄今為止，全球已有約100個左右經(jīng)冷凍卵子孕育的嬰兒的出生。,四、試管嬰兒,★ 1977年7月25號世界上第一例試管嬰兒——路易絲.布朗在英國呱呱墜地；1978年，印度創(chuàng)造了世界上第二例試管嬰兒。至1987年，有6000多個，1996——1997年間美國就有42463個。,★ 我國大陸也于1988年3月10號，在北京醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)室誕生了第一個試管嬰兒——鄭萌珠。,

15、★ 培育試管嬰兒，包括體外受精（invitro fertiliztion）和胚胎移植（embryo transfer，ET）兩個步驟。即在試管中將精子與卵結(jié)合受精，2·5天后，把發(fā)育到8細胞期的胚胎移植到子宮中去，發(fā)育成長，直至足月分娩。 （胚胎發(fā)育的第7—12天，即原腸化階段，是人生最關鍵的時刻）。 此項技術(shù)主要適用于各種女性原因的不孕、免疫性不孕、輕度少精癥等。,試管嬰兒的三個階段：第一代試管嬰兒：最

16、早成功的常規(guī)技術(shù)。第二代試管嬰兒：采用顯微受精技術(shù)將單個精子注射進卵細胞內(nèi)使其受精。適用于男性原因的不孕，如少精、弱精等。1996年，我國第二代試管嬰兒（ICSI）在中山醫(yī)科大學獲得成功。第三代試管嬰兒：對體外受精的胚胎取出細胞進行遺傳學診斷后再行胚胎移植。我國第三代試管嬰兒（PGD）在中山醫(yī)科大學獲得成功。 2000年3月，我國首例超快速冷凍胚胎移植的試管嬰兒在湖南醫(yī)科大學人類生殖工程研究室誕生，標志著我國在該領域的研究已

17、進入世界先進行列。 進一步，美國、日本、臺灣正研制多胞胎和“人造子宮”以完成懷孕全過程。,五、生物克隆技術(shù) （一）克隆概念的由來 （二）克隆研究的主要內(nèi)容 （三）克隆的理論基礎及發(fā)展史 （四）克隆的技術(shù)方法及制備程序 （五）克隆技術(shù)的應用及意義 （六）克隆技術(shù)存在的問題 （七）驚世駭俗的計劃——“克隆人”,,一個細菌一分為二；一根葡萄枝切成十段就可能變成十株葡萄；仙人掌切成幾塊，每塊落地就生根；一株草莓依

18、靠它沿地“ 爬走 ”的匍匐莖，一年內(nèi)就能長出數(shù)百株草莓苗；人們剪下植物枝條，扦插到土里，不久就會發(fā)芽，長出新的植株，這些植株是遺傳物質(zhì)組成完全相同的植株，這就是“克隆”。 還有將馬鈴薯等植物的塊莖切成許多小塊進行繁殖，由此而長出的后代也是“克隆”?！?凡此種種，都是生物靠自身的一分為二或自身的一小部分的擴大來繁衍后代，這就是無性繁殖，無性繁殖的英文名稱叫“Clone”，譯音為“克隆”。,（一） 克隆概念的由來,在動物界也有無性

19、繁殖，不過多見于非脊椎動物，如原生動物的分裂繁殖、尾索類動物的出芽生殖等。 但對于高級動物，在自然條件下，一般只能進行有性繁殖，所以要使其進行無性繁殖，科學家必須經(jīng)過一系列復雜的操作程序。如用未分化的胚胎細胞進行核移植稱為胚胎細胞克?。╡mbryoniccillcloning）；用已分化的體細胞（即非生殖細胞）。進行核移植稱之體細胞克?。╯omaticcellcloning）。 在本世紀50年代，科學家成功地無性繁殖出一

20、種兩棲動物—非洲爪蟾，揭開了細胞生物學的新篇章。,克?。–lone）一詞源于希臘園藝學家—Klone，后來指用“嫩枝”或“插條”來繁殖生物，意思是不需生殖細胞結(jié)合的繁殖方式 另一解釋：源于希臘語中的clonos，意為“ twig”，即嫩枝，clonizo是動詞砍下嫩枝的意思。指不使用種子就可以把老樹的嫩枝經(jīng)插條變成幼樹苗。 時至今日，"克隆"的含義已不僅僅是"無性繁殖"，凡來自一個

21、祖先，經(jīng)過無性繁殖出的一群個體，也叫"克隆"。,克隆是指從一個細胞得到的兩個以上的生物體、細胞群或細胞。甚至是一段DNA的拷貝片段。 因此，在生物的分子、細胞、個體三個不同層次上，“克隆”有不同的含義。,（二）克隆研究的主要內(nèi)容 1 供體細胞的來源和特性 胚胎細胞——發(fā)育至32-64個卵裂球的胚胎細胞 胚胎干細胞——來自胚胎內(nèi)細胞團 成年動物體細胞

22、 其共同的特性是細胞核的全能性。,2 細胞質(zhì)受體的來源和特性 具有全能性的細胞核是否具有重編程的能力，主要取決于胞質(zhì)的性質(zhì)。成熟卵母細胞（MⅡ期）是目前公認的成功受體。3 重構(gòu)胚核質(zhì)適應機理 核質(zhì)間細胞周期是否同期化、核重編程的能力如何和核質(zhì)相適應的機制等。4 克隆技術(shù)支持體系的研究 包括供核細胞和胞質(zhì)受體的采集技術(shù)和培養(yǎng)體系的研究；核移植操作技術(shù)及有關設備的研究。5 重構(gòu)胚胎的體內(nèi)和體外培養(yǎng)技術(shù)6

23、 克隆技術(shù)的使用化研究,（三）克隆的理論基礎及發(fā)展史,克隆的理論基礎：細胞的全能性； 克隆的技術(shù)基礎包括：核移植技術(shù) 胚胎移植技術(shù)等。,1932年，英國作家赫胥黎在他的小說《美麗新世界》中預言，人類科技發(fā)展到足以復制自身之時，便是世界陷入混亂之日。    1938年，德國胚胎學家提出動物克隆的設想：

24、即從發(fā)育到后期的胚胎中取出細胞核，將其移植到一個卵子中去，使其繁殖。     1950年，首次在-79℃成功地冷藏牛的精于，稍后與母牛的卵子進行了人工授精。     1951年，科學家培育出第一個人體腫瘤細胞系。     1952年，皮科克醫(yī)生宣稱他找到了370多種不用精子生殖海膽的方法。  

25、0;  1952年，第一次進行動物克隆，羅伯特·布瑞格和托馬斯·金對小蝌蚪的細胞核進行無性繁殖。,1953年，沃森和克里克發(fā)表了震驚世界的千字論文，揭開了生命遺傳物質(zhì)即DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。     1962年，英國科學家約翰·戈德首次利用已長出腿的蝌蚪細胞進行克隆實驗。     1970年，英國科學家約翰

26、·戈德和同事利用經(jīng)過培養(yǎng)的成年青蛙表皮細胞核克隆成功成年青蛙。     1973年，科恩和博依將外來基因插入活的有機體的實驗取得突破性進展。     1976年，美國設立“重組DNA管理委員會”，負責管理人體基因工程。     1977年，數(shù)百名美國人來到美國國家科學院舉行示威，其口號是：“我們不要克隆

27、”，“不要碰我的基因”!這是第一次對生物技術(shù)提出抗議。     1978年，電影《來自巴西的男孩子》中一個假定的情節(jié)是：克隆了一群小希特勒。     1978年，由英國科學家史德彼逑和愛德華茲共同培育出第一個試管嬰兒--路易斯。,1978年，大衛(wèi)·羅文克在《他的影像》一書中斷言人類自身可以克隆。     

28、;1981年，日內(nèi)瓦大學的研究人員利用胚胎移植技術(shù)培育出正常的老鼠。     1982年，遺傳工程師布林斯特培育出一只含有人體生長基因的轉(zhuǎn)基因老鼠。     1983年，第一次成功地進行了人類胚胎由一個母體向另一個母體的轉(zhuǎn)移。     1985年，布林斯特第一次成功地創(chuàng)造了第一頭轉(zhuǎn)基因家畜--即幾頭能夠分泌人類生

29、長荷爾蒙的豬。     1986年，作為人工授精試驗的志愿者懷特·海德懷胎十月產(chǎn)下一女嬰，但當她提出要撫養(yǎng) “自己的孩子”時，遭到了拒絕。     1986年，英國科學家首次利用胚胎細胞細胞核移植技術(shù)克隆出一頭羊。     1987年，美國里根政府將有關微生物專利注冊的規(guī)定，延伸到所有生物(包括動物)注

30、冊專利的規(guī)定。,1988年，格雷納德生物公司成功地利用改進型的細胞核移植技術(shù)來克隆奶牛。     1991年，美國國家衛(wèi)生與醫(yī)學博物館宣布，打算復制林肯身體組織樣本。     1991年，文特爾提出要對人體大腦中發(fā)現(xiàn)的337個基因擁有專利保護權(quán)和所有權(quán)。     1993年，電影《株羅紀公園》“克隆”了一大堆恐龍

31、。     1993年，人類胚胎克隆成功。     1994年，美國利用牛胚胎細胞核移植技術(shù)克隆牛成功。     1994年，中國利用山羊胚胎細胞核移植技術(shù)克隆山羊成功。     1996年，一部令人迷惑的電視動畫片《蜘蛛人》創(chuàng)造了一個克隆蜘蛛人的英雄形象。  

32、;   1997年，英國胚胎學家維爾穆特和他的同事宣稱用母羊的乳腺細胞克隆成功了第一只克隆羊。開創(chuàng)了成年哺乳動物克隆的先河。     1998年，克隆羊“多利”當上了媽媽，生下了一只名叫“邦尼”的小羊。,動物克隆研究的三個階段 　根據(jù)供核體細胞的不同和生物技術(shù)的發(fā)展，可將動物克隆研究分為三個發(fā)展階段： 胚胎細胞克隆階段 1981年，IIImensee

33、和Hoppe報道他們用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的內(nèi)細胞團細胞作為供核體，直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞質(zhì)中，重構(gòu)胚體外發(fā)育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宮，獲得了克隆小鼠，這是在哺乳類第一次用胚胎細胞進行核移植獲得成功，1983年，美國科學家利用核移植技術(shù)結(jié)合細胞融合方法獲得了克隆小鼠，1986年，英國的Willadsen用綿羊的8－16細胞階段的胚胎細胞作供體進行核移植，首次應用電融合的方法克隆出一只小羊。此后,其他科學家也相繼成功地

34、克隆出小鼠、綿羊、牛、兔豬和猴等。我國科學家也在20世紀90年代成功開展了胚胎細胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和豬等研究。以上這些克隆實驗中所用供核細胞均屬發(fā)育至不同階段的胚胎細胞。,同種體細胞克隆階段 1997年2月，英國羅斯林研究所Wilmut等人宣布他們用6歲成年羊的高度分化的乳腺細胞進行了核移植，成功地獲得了克隆羊“多莉”。1998年5月，美國科學家Robl的研究組利用胎兒成纖維細胞克隆出了3頭牛，而且攜帶了轉(zhuǎn)移的基因。199

35、8年7月，日本科學家Dato等用牛的輸卵管細胞克隆出了8頭小牛。1998年7月，美國夏威夷大學Yanagimachi領導的研究小組獲得小鼠卵丘細胞進行克隆再克隆小鼠成功的結(jié)果。1999年6月，Yanagimachi的研究小組又利用成年雄性小鼠尾尖的成纖維細胞為供核體細胞成功地克隆出了一只雄性小鼠，這也是第一只供體細胞不是來源于雌性動物被克隆的動物。此后，同種體細胞克隆山羊、豬、貓和兔也都相繼誕生。我國體細胞克隆山羊和克隆牛不論雌的還是雄

36、的也都已獲得成功。在同種體細胞克隆研究中。所用供核體細胞為高度分化的體細胞。,異種體細胞克隆階段 異種體細胞克隆是將一種動物的體細胞核移植到另一種動物的去核（遺傳物質(zhì)）卵母細胞中。 由于瀕危物種的個體數(shù)量少，很難提供用于克隆的卵母細胞和代孕受體，這就促使科學家提出了異種克隆的設想。 異種克隆研究面臨著許多問題，如體細胞核能否在異種卵胞質(zhì)中去分化并支持早期胚泡發(fā)育？異種核質(zhì)能否相容？異種重構(gòu)胚能否著床并進行全程發(fā)育

37、等問題。 1999年，中科院動物所實驗室將成年大熊貓體細胞作為供核體細胞移植到去核（遺傳生物）日本大耳白兔卵母細胞中成功地構(gòu)建異種重構(gòu)胚，體外培養(yǎng)獲得孵化囊胚。2001年將重構(gòu)胚移植寄母子宮，獲得了著床的重大進展。2002年，不僅異種重構(gòu)胚能夠在異種寄母子宮中著床，而且還能發(fā)育，這是異種克隆大熊貓研究中攻克的最后一個難題中的最新進展。,明代吳承恩：《西游記》 1932年赫胥黎（英國） 《美麗的新世界》 1978年

38、，美國《按照他的面貌：克隆一個人》（The Cloning of a man）。戴維.羅維克（David Rorvik），！ 神話→科幻→現(xiàn)實 通向“多莉”之路——哺乳動物的克隆史 魏斯曼（August Weismann）是最初解釋胚胎發(fā)育的德國科學家。中心思想是：一旦受精卵第一次分裂，形成兩細胞胚

39、胎時遺傳信息便開始消減了！細胞的分化是由于通過細胞的分裂，遺傳物質(zhì)（基因）丟失的原因。 博韋理（Theodor Boveri）,德國細胞學家，發(fā)現(xiàn)馬蛔蟲的染色體消減現(xiàn)象。,W.魯（Wilhelm Roux）,德國胚胎學家，金線蛙卵的針燙實驗。 德里斯（Driesch），海膽卵的震蕩實驗。 漢斯.施佩曼（Hans Spemann）德國大胚胎學家。1902年進行了蠑螈結(jié)扎實驗。1928年進行了首次

40、核移植實驗。他的工作促使世界各國科學家開始了克隆動物的征程。 布里格斯（Briggs）和托馬斯.金(Thomas J. King)，美國哈佛大學。 1952年進行北方豹蛙核移植實驗，先后獲得了蝌蚪和成體蛙。（用胚胎發(fā)育早期的細胞核獲得克隆蛙，但利用分化細胞、種間細胞未獲成功）。,20世紀50年代前的工作結(jié)論：克隆胚胎細胞能發(fā)育到成體蛙，克隆成體蛙細胞能發(fā)育到蝌蚪，沒有人能做出每個人都期待的關鍵實驗——從成體蛙的細胞克隆

41、出一只成體蛙！（分化細胞發(fā)育的局限性和種間核移植的局限性） 約翰.格登（John Gurdon）,英國牛津大學發(fā)育生物學家。1962年利用非洲爪蟾（蝌蚪）的腸細胞核移植實驗。成功的克隆出一只成體蛙。（說明已分化的細胞核進行核移植成功，打破了細胞發(fā)育的局限性）。 童第周，實驗胚胎學家。1963年，從事克隆魚的研究，證實了不同種的生物間（鯉魚和鯽魚）也可成功進行核移植，打破了物種之間的禁區(qū)。70年代黑斑蛙的紅細胞

42、核移植實驗。 1981年，我國武漢水生生物研究所的科研人員，利用腎臟細胞克隆出世界上第一條克隆鯽魚。首次證明了成年細胞也可以去分化和再程序化，可惜當時沒有得到更多的認可。,1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學的卡爾伊爾門澤和美國的杰克遜實驗室首瓷對小鼠進行移核實驗。他們將囊胚內(nèi)細胞團細胞的核移入去核的受精卵中，獲得核移植克隆鼠，這是首次報道克隆哺乳動物成功的例子。 自開展哺乳動物的克隆以來，世界各國都作出了出色的卓有成效的工作

43、。 1984年，維拉達森（Willadson），英國劍橋大學生殖生物學家。成功的把羊的8細胞胚胎的核轉(zhuǎn)移到未受精的去核卵中，得到真正的克隆哺乳動物——克隆羊。 1986年，維拉達森又成功的克隆出牛。,1991年，西北農(nóng)業(yè)大學獲得5只克隆山羊； 1992年，江蘇省農(nóng)科院，中科院發(fā)育所、分別報道得到了“克隆兔”。 1993年，我國臺灣得到5頭“克隆豬”。 1994年，美國科學家菲兒斯特得到

44、了“克隆?！?。隨后，我國華南師范大學、中科院畜牧所也得到“克隆?！?。 1996年，美國用核移植的辦法得到了3只“克隆猴”。 目前，已克隆的哺乳動物有小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛、猴等。,美國（1952年前）→英國（1963年）→中國（1970年前后）→英國 第一階段 第二階段 第三階段,動物克隆史上的豐碑——“多莉”的誕生（體細胞的克隆）

45、 1997.2.27，英國《Nature》刊登“來自胎兒和成年乳腺細胞的成活后代”文章，報道了蘇格蘭愛丁堡的羅斯林（Roslin）研究所維爾穆特（Wilmut）的出色工作，實現(xiàn)了哺乳動物體細胞的克??！ 1996.7.5，利用克隆技術(shù)培育出世界上第一只只有母親，沒有父親的哺乳動物——“多莉”（Dolly）小綿羊誕生了。 Wilmut在克隆“多莉”時，同時做了三種細胞：來自9天的胚胎細胞；26天的胎兒分化

46、皮膚細胞；凍存的成體（6歲）乳腺上皮細胞，都分別獲得了后代。最引人注目的是6歲母羊乳腺上皮細胞的克隆成功！ 移植277個乳腺上皮細胞，獲得29個胚胎（桑椹期或囊胚期），移植到代孕母羊的子宮中，最后產(chǎn)下一只小羊——“多莉”,芬多席特白面羊（6歲）,蘇格蘭黑面羊,乳腺上皮細胞（凍存3個月）,卵細胞,細胞核,取出細胞核,去核卵,換核卵細胞,體外培養(yǎng),代孕母羊,“多莉”（白面羊的復制品）,,,,,,,,,克隆綿羊“多利”沒有父

47、親，卻有三位母親。整個克隆過程如下： 首先，科學家從一只產(chǎn)自芬蘭的6歲成年多塞特母綿羊A（“多利”的親生母親）的乳腺中取出一個本身并沒有繁殖能力的普通細胞，將這個細胞的基因分離出來備用。 然后，科學家在取出另一只母綿羊B（“多利”的借卵母親）的未受精的卵細胞，將這個卵細胞中的基因取出，換上母綿羊B的乳腺細胞的基因，形成一個含有新遺傳物質(zhì)的卵細胞，再將這個基因已被“調(diào)包”的卵細胞放電激活，促使它分裂發(fā)育成胚胎。

48、最后，當胚胎生長到一定程度時，將它植入第三只母綿羊C（“多利”的代孕母親）的子宮中，經(jīng)過正常的妊娠產(chǎn)下“多利”。 　多利完全繼承了其親生母親――多塞特母綿羊的全部DNA基因特征，是多塞特母綿羊百分之百的“復制品”。,☆Wilmut克隆“多莉”的生物學意義及幾個關鍵問題,△具有豐富的保存卵細胞和其它細胞的經(jīng)驗,△掌握了熟練的核移植．等關鍵性技術(shù),△對受精卵進行了電刺激處理，起激活作用,△采用細胞同步化技術(shù)，使受體和供體細胞均處在細胞周期

49、的G0期,△已經(jīng)成功的進行了先期克隆實驗,1976年3月7日，Wilmut就在《Nature》報道了利用羊的胚胎細胞克隆出兩只雙生羊——麥根（Megan）和莫龍格（Moroag）,‘多莉’的誕生激勵各國科學家進一步研究哺乳動物的克隆問題。 1997年，先后得到克隆羊、克隆牛等。 1998年7月，一組科學家（日、美、英、意）在美國檀香山宣布：他們已經(jīng)用經(jīng)卵泡細胞的細胞核克隆成功的小鼠“卡紐麗娜”再克隆出下

50、一代，祖孫三代50只克隆鼠組成的大家庭具有完全一致的遺傳基礎。（成功率達到2%，被稱為“檀香山技術(shù)”）。 1998年3月，法國得到克隆?！R格麗特“ 4月，新西蘭得到克隆?！凹?5月，美國得到克隆?！皢讨巍焙汀安闋査埂?10月，中國杜淼獲胎兒成纖維細胞克隆山羊 1998年底，《科學》報道德國科學家得到成年牛卵丘細胞和輸

51、卵管上皮細胞 “克隆?！薄?1999年元旦剛過，在日本北海道降生了一頭用耳細胞核克隆的良種奶牛。,2000年1月，美籍華人楊向忠利用體外培養(yǎng)的公牛耳皮細胞成功克隆出6頭牛犢。打破了科學界認為只有利用新鮮或短期培養(yǎng)的細胞才能克隆的傳統(tǒng)觀念。 2000年1月，《科學》報道第一個靈長目動物——恒河猴被克隆。 2001年11月3日，我國首例健康成活的胎兒皮膚細胞克隆?！翱悼怠?、2001年11月6日

52、，同樣用牛胎兒皮膚上皮細胞核克隆出“雙雙”在萊陽農(nóng)學院誕生。 2002年1月18日，中國第一頭本土克隆?！拔痹诓芸h通過剖腹產(chǎn)誕生，不久死去。,2002年2月11日，中科院動物所陳大元和曹縣五里墩中大動物胚胎工程中心聯(lián)手利用成年體細胞克隆牛群體成功。（優(yōu)質(zhì)成年牛的耳成纖維細胞核，共產(chǎn)14只，存活5頭） 綜上所述可見：幾個世紀以來人類夢寐以求的快速、大量繁殖純種動物的夙愿，在世紀之交已變成了現(xiàn)

53、實。 我國科學家自1998年宣布了雄心勃勃的異種借腹克隆大熊貓的計劃，目前中科院的陳大元研究員將大熊貓的體細胞核植入去核兔卵中，已成功的在體外培育出了大熊貓胚胎，進一步攻克的防線和難關是胚胎的異種著床。,（四）克隆的技術(shù)方法及制備程序 主要指以細胞核移植為核心技術(shù)的無性繁殖技術(shù)。1 細胞核移植技術(shù) ★概念及發(fā)展史 是一種利用顯微操作技術(shù)將一種動物的細胞核移入同種或異種動物的去核成熟卵內(nèi)的精細操作技術(shù)。

54、包括胚胎細胞核移植和體細胞核移植兩種。通過此技術(shù)可獲得核質(zhì)雜種。,利用核移植技術(shù)，可以研究胚胎發(fā)育過程中細胞核和細胞質(zhì)的功能及相互作用關系；探索有關遺傳、發(fā)育和細胞分化等方面的理論等問題，后來才將此技術(shù)應用于克隆。,1928年，德國胚胎學家施佩曼（Hans Spemann）第一個提出細胞核移植的設想并進行了首次核移植實驗的嘗試。他的工作促使世界各國科學家開始了克隆動物的征程。 1952年，布里格斯（Briggs）和托馬斯.金(

55、Thomas J. King)，美國哈佛大學。 進行北方豹蛙核移植實驗，先后獲得了蝌蚪和成體蛙。（用胚胎發(fā)育早期的細胞核獲得克隆蛙，但利用分化細胞、種間細胞未獲成功）。 1958-1962年間，英國劍橋大學利用爪蟾原腸內(nèi)胚層細胞核移植，培育出可育非洲爪蟾。 1977年，開始在小鼠進行哺乳動物的核移植，并先后取得了突破性進展。 我國的核移植實驗開始于20世紀50年代。著名科學家童第周先后在兩棲類和魚類做出了在世界

56、上極有影響的工作，特別是他同牛滿江合作，實現(xiàn)了不同種間的核移植，成功地無性繁殖了“鯉鯽核魚”。（鯽魚核→鯉魚去核卵中）,2 細胞核移植的技術(shù)要點 核移植的眾多工作為后來的動物克隆打下了良好的基礎。下面簡要說明細胞核移植的技術(shù)要點： （1）受體體細胞的準備 受體為成熟的卵細胞。采用機械法（剝離）或化學法（胰蛋白酶）去卵膜，然后用玻璃微針挑出細胞核或紫外線照射使核物質(zhì)分解以達到去核的目的。 （2） 供體細胞的

57、準備 供體通常選用： 胚胎細胞——發(fā)育至32-64個卵裂球的胚胎細胞 胚胎干細胞——來自胚胎內(nèi)細胞團 成年動物體細胞 其共同的特性是細胞核具有全能性。,（3）移核 選擇合適的微吸管穿過透明帶注入去核卵母細胞中，避免移入過多的細胞質(zhì)、控制溫度，短時間內(nèi)完成。還可用供核細胞和卵母細胞的融合實現(xiàn)核轉(zhuǎn)移。 （4）融合和激活 融合是指用某種方法使核與胞質(zhì)融為一體的過程；

58、 激活是通過某種刺激使卵子內(nèi)鈣離子濃度升高，給卵一個啟動信號，促使細胞周期的恢復。,3 克隆動物的制備程序,核供體動物的選擇與細胞核的獲得,核受體動物的選擇與細胞核的移出,供體核的移入及原核的取出,胚泡的體外試管培養(yǎng),代母的選擇與胚泡移入子宮,克隆動物的體內(nèi)發(fā)育與出生,,,,,,,根據(jù)細胞核的來源不同，一般分為胚胎細胞核移植法、胚胎干細胞移植法、胎兒成纖維細胞移植法和體細胞核移植法，其基本程序大體一致。,1）胚胎細胞核移植法

59、 將未著床的早期胚胎分散成單個細胞，然后分別取核進行核移植，發(fā)育成胚胎后再行胚胎移植、發(fā)育分娩。也可通過細胞融合法將供體核移入去核卵的方法。2）胚胎干細胞移植 首先制作胚胎干細胞系，再進行細胞核移植，可克隆出更多的動物個體。此法在小鼠較為成熟。3）胎兒成纖維細胞核移植 從早期胎兒分離成纖維細胞進行核移植。 1998年5月，美國科學家Robl的研究組利用胎兒成纖維細胞克隆出了3頭牛，而且攜帶了轉(zhuǎn)移的基因。,,

60、4）體細胞克隆技術(shù) 1997年2月，英國羅斯林研究所Wilmut等人宣布他們用6歲成年羊的高度分化的乳腺細胞進行了核移植，成功地獲得了克隆羊“多莉”。榮登Science雜志評出的1997年世界十大科技成就之首。,芬多席特白面羊（6歲）,蘇格蘭黑面羊,乳腺上皮細胞（凍存3個月）,卵細胞,細胞核,取出細胞核,去核卵,換核卵細胞,體外培養(yǎng),代孕母羊,“多莉”（白面羊的復制品）,,,,,,,,,,☆遺傳素質(zhì)完全一致的克隆動物將有利于開展

61、對動物（人） 生長發(fā)育、衰老和疾病健康等機理的研究,☆拯救瀕臨滅絕的動物（異種克隆、借腹懷胎），保護基因資源,☆大量快速擴大和繁殖高經(jīng)濟性狀（品質(zhì)優(yōu)良）的牲畜（禽）,☆克隆轉(zhuǎn)基因動物，創(chuàng)建活的藥廠，提供廉價的藥品和保健品,☆提高臨床醫(yī)學的治療手段（提供易被接受的移植器官）,☆解決不育癥，作為生育的輔助措施——“克隆人”,☆DNA大量拷貝（DNA 克?。?（五）克隆技術(shù)的實踐應用及意義,動物克隆的廣泛開展，進一步驗證了細胞的全能

62、性,,克隆技術(shù)最重要的用途體現(xiàn)在兩方面：一是大規(guī)模繁殖良種動物，包括轉(zhuǎn)基因動物；二是克隆瀕危動物。前者，可生產(chǎn)基因藥物。伊恩·威爾莫特在克隆多利之前，先從英國PPL基因工程公司得到了一批轉(zhuǎn)基因羊，這種羊的基因中帶有人體的一個功能性基因，并在母羊的乳腺中表達出來。 克隆瀕危動物，最典型的例子就是大熊貓。現(xiàn)在大熊貓總數(shù)只有1000頭左右，因其數(shù)量非常有限，因此用大熊貓的卵細胞克隆不現(xiàn)實。有科學家提出了“異體克隆”，即大

63、熊貓的體細胞和兔子的卵細胞克隆，但這項工作目前進行得比較艱難，國內(nèi)科學家正努力將這一研究進行下去。,,（六） 克隆技術(shù)存在的問題（克隆留給我們的思考） ☆ 技術(shù)尚不成熟，成本高、效率及成活率低,移植434只成體綿羊的乳腺上皮細胞核至相同數(shù)量的綿羊卵子中，產(chǎn)生了277個融合細胞（成功率為63.8%）。 將此融合細胞移入母羊輸卵管成功247個（89.2%），只獲得29個發(fā)育到桑椹期或囊胚期的胚胎11.7%）。

64、 移植到13只代孕母羊的子宮中，僅有一頭羊懷胎（7.7%）最后產(chǎn)下一只小羊——“多莉”(總成功率為0.23%)。,☆存在嚴重的生理或免疫缺陷 ☆ 克隆動物的壽命問題，克隆動物存在嚴重的早衰問題，夭折率高達75%。（多莉DNA遭損傷，明顯衰老，端粒比同齡羊縮短約20%，與6歲供體核母羊相似）,關于克隆動物是否早衰的爭論大體分兩派，一派認為，克隆動物的端粒比較短，克隆動物的基因不正常，克隆動物早衰是一個根本

65、現(xiàn)象。另一派則認為，克隆動物的遺傳物質(zhì)是正常的，目前發(fā)現(xiàn)的早衰跡象是在克隆過程中出現(xiàn)的一些技術(shù)問題造成的，或者克隆動物在發(fā)育中出現(xiàn)了變異，早衰只是屬偶然現(xiàn)象，也許有的變異使得克隆動物更加長壽。不過由于目前全世界的克隆動物較少，誕生時間都不很長，因此到目前為止這一問題尚未有定論。,“多利的早死，早就預料到了” 2003年2月14日，培育出多利的英國蘇格蘭羅斯林研究所發(fā)表新聞公報說，由于獸醫(yī)檢查發(fā)現(xiàn)多利患有進行性肺病，研究人員對它實

66、施了“安樂死”。進行性疾病系指癥狀不斷加重、狀況不斷惡化的疾病。 “多利的早死，早就預料到了！”專家們?nèi)缡钦f。生物壽命由基因密碼決定，但多利是通過體細胞移植進行無性繁殖的產(chǎn)物，其基因是一成不變的。比如，一個人自然壽命是120年，如果拿一個50歲的人的體細胞克隆，其后代的自然壽命就會減去50歲而縮短到70年。多利3歲時做了一次基因組檢測，發(fā)現(xiàn)染色體端粒長度比正常羊短20％，而端?？s短是衰老的標志。根據(jù)染色體長度推算下來，多利3歲時

67、的衰老程度與其“代理母親”9歲時一樣。此外，在進行克隆操作的時候，基因會不可避免地受到損傷，這就導致克隆動物免疫上的先天缺陷。基于這樣的分析，專家認為多利的早死是必然的。,☆ 克隆動物和原來一樣嗎（是否是完全的復制？） ☆ 受體細胞的選擇問題（卵細胞以外的細胞可以嗎？） ☆ 恐龍可以被克隆嗎？（恐龍細胞核、卵、代孕母親） ☆ 社會學、倫理學問題——克隆人,,1 克隆人爭論的由來

68、 2 克隆人可能嗎？ 3 能克隆出一個正常人嗎？ 4 克隆人的社會地位（處境）如何？ 5 世界各國的態(tài)度及我國立場,（七）驚世駭俗的計劃——“克隆人”,,1997年克隆綿羊“多莉”后引發(fā)出的對克隆人的思考和顧慮，并激起了各國政府的強烈反響。 自從2003年邪教組織雷爾教派的科學家布里吉特·布瓦瑟利耶聲稱已“培育出世界第一個克隆嬰兒”后，國際輿論

69、一直沸沸揚揚，科學界則始終持質(zhì)疑的態(tài)度。然而，由此引發(fā)的“克隆人”熱卻至今溫度不減。 多數(shù)西方國家政府，領袖以及宗教界人士紛紛發(fā)表聲明反對克隆人，也有不少國家制定了禁止克隆人的法令。在這種情況下，依然在國際社會還有人要進行克隆人。 如意大利婦科專家安蒂諾利，美國專家扎沃斯，還有在美國的法國女科學家布利吉特，布瓦瑟利耶。她在2002年12月27日于美國佛羅里達州宣布“26日世界上第一個‘克隆人’誕生了”，除了人們的震驚外

70、，緊接著是一片質(zhì)疑和反對聲。,1998年新年伊始，美國一位物理學家公開向新聞媒體宣布了他自己輝煌的“克隆人”計劃。此人名叫理查德.錫德，70歲，哈佛大學教授， 意大利胚胎學家安蒂諾里和美國一女科學家，已經(jīng)征集了200多位女性在公海的一只游船上進行克隆人的試驗。 英國和韓國已于1998年用人的體細胞克隆成功人的胚胎，由于法律約束又銷毀了。 維爾穆特1999年月初在英國宣布他領導的

71、科研小組正著手實施克隆人體胚胎的計劃。 1999年6月，美國馬薩諸州成功克隆出人的胚胎。,2001年11月25日美國先進細胞技術(shù)公司（ACT）報道了利用克隆技術(shù)培育出人類早期胚胎（4、6細胞期），這個消息一瞬間就傳遍了世界，在全球引發(fā)軒然大波，激起了各國爭議，因為它離克隆人只有一步之遙。 因為構(gòu)建成的胚胎只要移入婦女子宮，就有可能發(fā)育成個體（即克隆人），它比治療性克隆技術(shù)的復雜程序要簡單得多。因此，人們十分擔心