1、一、動物人工繁殖 包括有性生殖和無性生殖兩條途徑。前者的關(guān)鍵技術(shù)是人工受精與體外受精，后者的關(guān)鍵技術(shù)是核移植，兩者都涉及胚胎培養(yǎng)與移植。胚胎工程是通過在生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞水平上的顯微操作技術(shù)，來定向控制、改造和創(chuàng)造新遺傳性狀的技術(shù)，是動物細(xì)胞工程的拓展和延伸。又稱發(fā)育工程（revelopmental technology）。,第六章、動物人工繁殖,二、發(fā)展歷史及意義 發(fā)展歷史 胚胎移植技術(shù)是胚胎工程的

2、基礎(chǔ)。 1891年，英國人希普首次在兔子身上成功的進行了核移植。 20世紀(jì)30年代，陸續(xù)在鼠、兔、羊、豬、牛和馬進行胚胎移植實驗，相繼獲得成功。 20世紀(jì)60年代以來，隨著胚胎移植技術(shù)的不斷成熟和規(guī)范化，以及一系列新方法的建立，胚胎工程進展迅速，以日本、澳大利亞和加拿大發(fā)展最快。 1987年，美國用家貓做代理母親，移植了一只瀕臨滅絕的珍貴貓的受精卵，成功獲得試管貓。 我國自20世紀(jì)70年代開始發(fā)展

3、該技術(shù)，進展也較迅速，但與世界先進國家相比，還存在較大差距。 1977年，英國科學(xué)家首次創(chuàng)造了世界上第一個試管嬰兒。,意 義 1 發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖能力 胚胎移植技術(shù)是提高母畜繁殖潛力的有效方法，擴大良種雌性配子的推廣利用。（超數(shù)排卵、同步發(fā)情） 2 促進家畜改良的速度（泌乳高的奶牛、瘦肉型豬、毛肉兼用的細(xì)毛羊等） 3 作為胚胎操作的基礎(chǔ)（卵子切割、性別控制、嵌合體制作、細(xì)胞

4、核移植、轉(zhuǎn)基因操作等） 4 保存遺傳資源 胚胎超低溫冷凍技術(shù)的運用，給長期保存和運輸、異地移植帶來方便，還可用于建立“胚胎庫”等。,三、胚胎工程,2 卵子回收及成熟培養(yǎng),1 精子的采集及體外獲能 精子獲能分為體內(nèi)獲能與體外獲能 體外獲能：第一步離心，第二步洗滌改變膜的滲透性,3 卵子和精子的體外受精（in vitro fertilization IVF） 受精成功的標(biāo)志至少是看受精卵是否可以發(fā)育至囊胚期

5、階段,4 受精卵的體外發(fā)育及體外培養(yǎng),（一）、人工受精,指從某個體采胚或?qū)⒃嚬軆?nèi)的受精卵（8細(xì)胞以上或囊胚期）移植到另一個體的輸卵管或子宮中去的技術(shù)。 提供胚胎或受精卵的母畜稱為“供體”。 接受胚胎或受精卵的母畜稱為“受體”，又稱“代孕母體”或“代理母親”。 來自供體的胚胎能夠在受體的子宮著床，并繼續(xù)生長和發(fā)育，最后產(chǎn)下供體的后代，即是所謂的“借腹懷胎”。,（二）、 胚胎移植（embryo transfer，E

6、T）,1 胚胎移植的最佳時期 體外培養(yǎng)受精卵發(fā)育至8細(xì)胞以上的胚胎（囊胚期）時是胚胎移植的最佳時期。早期胚胎發(fā)育的三個階段： 1）桑椹胚 卵裂球分裂到16-32細(xì)胞時，成為一緊密的細(xì)胞團，稱為桑椹胚。在2-8個細(xì)胞時，每個細(xì)胞均具有全能性。 2）囊胚 在胚胎內(nèi)形成空腔，逐漸變大成為囊胚腔，此時一端細(xì)胞個體較大，形成密集（三層）的內(nèi)細(xì)胞團（ICM），將來發(fā)育成胚體。另一端只有環(huán)透明帶一層細(xì)胞，稱滋養(yǎng)層，將來發(fā)

7、育成胚膜。 3）原腸胚 囊胚進一步發(fā)育，內(nèi)細(xì)胞團外的滋養(yǎng)層退化，內(nèi)細(xì)胞團裸出形成胚盤，在胚盤下方衍生出內(nèi)胚層，此時胚胎稱原腸胚。,(圖),（圖）,（圖）,下頁,,,返回,,,返回,,,返回,2 超數(shù)排卵 在母畜發(fā)情周期的適當(dāng)時間用人工方法促使其有更多的卵泡發(fā)育、成熟、排卵的一項技術(shù)。 方法是注射促性腺激素，如孕酮、雌二醇、促卵泡激素、促黃體激素、促性腺激素釋放激素等。3 同步發(fā)情 指使供體和受體同步發(fā)

8、情，即處于相同的生殖周期。4 人工受精和胚胎的采集、鑒別 超排卵處理的母體在停藥后24-48小時開始發(fā)情，此時可進行人工受精，以后約在3-7天從母體采集受精卵或胚胎。正常發(fā)育的胚胎，其中細(xì)胞(卵裂球)外形整齊，大小一致，分布均勻，外膜完整。無卵裂現(xiàn)象(未受精)和異常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植。5 胚胎移植 外科手術(shù)法或非手術(shù)法,下頁,胚胎采集：,1. 手術(shù)法,2. 非手術(shù)法,,返回,（三）胚胎分割

9、 采用顯微操作技術(shù)，將早期胚胎切割成多份，再移植給受體母畜，達到實現(xiàn)同卵多胎后代的目的。（四）胚胎融合 又稱胚胎嵌合。將兩枚或兩枚以上的胚胎（同種或異種）的部分或全部細(xì)胞融合在一起，使之發(fā)育成一個胚胎，然后移植到受體母畜體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育形成一種嵌合體后代的技術(shù)。,（五）動物性別控制與胚胎性別鑒定 性別控制 通過人為干預(yù)或操作手段使母畜繁殖所需要的某一性別的后代。 性別控制主要用于家畜，可通過兩條途徑：即X

10、與Y精子的分離技術(shù)和胚胎性別鑒定。 1） X與Y精子的分離技術(shù) 包括免疫學(xué)分離法和流式細(xì)胞分離法。前者是利用Y精子上存在雄性特異性組織相容性抗原（H-Y抗原）,利用H-Y抗體進行檢測分選。后者是根據(jù)X精子和Y精子中DNA含量的差異，在流式細(xì)胞儀上分選。,2） 胚胎性別鑒定 指利用細(xì)胞生物學(xué)或分子生物學(xué)的方法識別胚體性狀，有效控制動物后代性別比例的技術(shù)。 細(xì)胞生物學(xué)方法：通過核型分析對胚體進行

11、性別鑒定 分子生物學(xué)方法：通過PCR擴增Y染色體上性別決定區(qū)的Y基因（SRY）來進行胚體性別鑒定。 另外，可以通過激活卵母細(xì)胞實現(xiàn)孤雌生殖以及克隆技術(shù)實現(xiàn)家畜的性別控制。,（六）胚胎冷凍保存技術(shù) 這是在冷凍細(xì)胞的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，包括精子、卵母細(xì)胞和早期胚體的冷凍保存，在此只介紹胚胎的保存。 短期臨時保存：指將暫時不使用的胚胎在37℃培養(yǎng)液中保存，或在活體同種或異種動物的輸卵管內(nèi)保存1-2天。也可將胚胎置

12、0-4℃低溫下保存2-3天。 長期冷凍保存：有儀器程序逐步降溫冷凍和徒手操作的快速玻璃化冷凍。前者利用冷凍儀按編程由室溫逐步降溫至零下196℃（液氮）保存。所用冷凍劑一般為二甲基亞砜、氨基酸、甘油等。后者是直接加入高濃度的抗凍液（玻璃化冷凍保護液）急速冷凍，有液體轉(zhuǎn)化為透明膠狀固體。 胚胎冷凍技術(shù)首次成功是1971年在小鼠進行的，至今該技術(shù)已逐漸完善，世界各國已相繼建立起許多動物，包括人的精液庫和胚胎庫等，在這方面已形成

13、一門獨立的學(xué)科——冷凍生物學(xué)或低溫生物學(xué)。,科學(xué)時報2004年9月28日報道：9月23日，全球首位成功進行自體卵巢再移植并自然受孕的女性，32歲的比利時婦女陶拉特順利分娩出一個女嬰。 1997年，25歲的陶拉特因患淋巴癌需接受化療和放療，為保證今后的正常生育能力，醫(yī)療組將其卵巢組織取出，在零下196度的液氮中冷凍保存起來。6年后（2003年2月）陶拉特癌癥治愈，將其冷凍卵巢移植回她的體內(nèi)，4個月后恢復(fù)排卵功能，不久成功自然受孕。

14、 這種冷凍卵巢技術(shù)是源于早期的卵子冷凍技術(shù)。迄今為止，全球已有約100個左右經(jīng)冷凍卵子孕育的嬰兒的出生。,四、試管嬰兒,★ 1977年7月25號世界上第一例試管嬰兒——路易絲.布朗在英國呱呱墜地；1978年，印度創(chuàng)造了世界上第二例試管嬰兒。至1987年，有6000多個，1996——1997年間美國就有42463個。,★ 我國大陸也于1988年3月10號，在北京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)室誕生了第一個試管嬰兒——鄭萌珠。,

15、★ 培育試管嬰兒，包括體外受精（invitro fertiliztion）和胚胎移植（embryo transfer，ET）兩個步驟。即在試管中將精子與卵結(jié)合受精，2·5天后，把發(fā)育到8細(xì)胞期的胚胎移植到子宮中去，發(fā)育成長，直至足月分娩。 （胚胎發(fā)育的第7—12天，即原腸化階段，是人生最關(guān)鍵的時刻）。 此項技術(shù)主要適用于各種女性原因的不孕、免疫性不孕、輕度少精癥等。,試管嬰兒的三個階段：第一代試管嬰兒：最

16、早成功的常規(guī)技術(shù)。第二代試管嬰兒：采用顯微受精技術(shù)將單個精子注射進卵細(xì)胞內(nèi)使其受精。適用于男性原因的不孕，如少精、弱精等。1996年，我國第二代試管嬰兒（ICSI）在中山醫(yī)科大學(xué)獲得成功。第三代試管嬰兒：對體外受精的胚胎取出細(xì)胞進行遺傳學(xué)診斷后再行胚胎移植。我國第三代試管嬰兒（PGD）在中山醫(yī)科大學(xué)獲得成功。 2000年3月，我國首例超快速冷凍胚胎移植的試管嬰兒在湖南醫(yī)科大學(xué)人類生殖工程研究室誕生，標(biāo)志著我國在該領(lǐng)域的研究已

17、進入世界先進行列。 進一步，美國、日本、臺灣正研制多胞胎和“人造子宮”以完成懷孕全過程。,五、生物克隆技術(shù) （一）克隆概念的由來 （二）克隆研究的主要內(nèi)容 （三）克隆的理論基礎(chǔ)及發(fā)展史 （四）克隆的技術(shù)方法及制備程序 （五）克隆技術(shù)的應(yīng)用及意義 （六）克隆技術(shù)存在的問題 （七）驚世駭俗的計劃——“克隆人”,,一個細(xì)菌一分為二；一根葡萄枝切成十段就可能變成十株葡萄；仙人掌切成幾塊，每塊落地就生根；一株草莓依

18、靠它沿地“ 爬走 ”的匍匐莖，一年內(nèi)就能長出數(shù)百株草莓苗；人們剪下植物枝條，扦插到土里，不久就會發(fā)芽，長出新的植株，這些植株是遺傳物質(zhì)組成完全相同的植株，這就是“克隆”。 還有將馬鈴薯等植物的塊莖切成許多小塊進行繁殖，由此而長出的后代也是“克隆”。…… 凡此種種，都是生物靠自身的一分為二或自身的一小部分的擴大來繁衍后代，這就是無性繁殖，無性繁殖的英文名稱叫“Clone”，譯音為“克隆”。,（一） 克隆概念的由來,在動物界也有無性

19、繁殖，不過多見于非脊椎動物，如原生動物的分裂繁殖、尾索類動物的出芽生殖等。 但對于高級動物，在自然條件下，一般只能進行有性繁殖，所以要使其進行無性繁殖，科學(xué)家必須經(jīng)過一系列復(fù)雜的操作程序。如用未分化的胚胎細(xì)胞進行核移植稱為胚胎細(xì)胞克隆（embryoniccillcloning）；用已分化的體細(xì)胞（即非生殖細(xì)胞）。進行核移植稱之體細(xì)胞克?。╯omaticcellcloning）。 在本世紀(jì)50年代，科學(xué)家成功地?zé)o性繁殖出一

20、種兩棲動物—非洲爪蟾，揭開了細(xì)胞生物學(xué)的新篇章。,克?。–lone）一詞源于希臘園藝學(xué)家—Klone，后來指用“嫩枝”或“插條”來繁殖生物，意思是不需生殖細(xì)胞結(jié)合的繁殖方式 另一解釋：源于希臘語中的clonos，意為“ twig”，即嫩枝，clonizo是動詞砍下嫩枝的意思。指不使用種子就可以把老樹的嫩枝經(jīng)插條變成幼樹苗。 時至今日，"克隆"的含義已不僅僅是"無性繁殖"，凡來自一個

21、祖先，經(jīng)過無性繁殖出的一群個體，也叫"克隆"。,克隆是指從一個細(xì)胞得到的兩個以上的生物體、細(xì)胞群或細(xì)胞。甚至是一段DNA的拷貝片段。 因此，在生物的分子、細(xì)胞、個體三個不同層次上，“克隆”有不同的含義。,（二）克隆研究的主要內(nèi)容 1 供體細(xì)胞的來源和特性 胚胎細(xì)胞——發(fā)育至32-64個卵裂球的胚胎細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞——來自胚胎內(nèi)細(xì)胞團 成年動物體細(xì)胞

22、 其共同的特性是細(xì)胞核的全能性。,2 細(xì)胞質(zhì)受體的來源和特性 具有全能性的細(xì)胞核是否具有重編程的能力，主要取決于胞質(zhì)的性質(zhì)。成熟卵母細(xì)胞（MⅡ期）是目前公認(rèn)的成功受體。3 重構(gòu)胚核質(zhì)適應(yīng)機理 核質(zhì)間細(xì)胞周期是否同期化、核重編程的能力如何和核質(zhì)相適應(yīng)的機制等。4 克隆技術(shù)支持體系的研究 包括供核細(xì)胞和胞質(zhì)受體的采集技術(shù)和培養(yǎng)體系的研究；核移植操作技術(shù)及有關(guān)設(shè)備的研究。5 重構(gòu)胚胎的體內(nèi)和體外培養(yǎng)技術(shù)6

23、 克隆技術(shù)的使用化研究,（三）克隆的理論基礎(chǔ)及發(fā)展史,克隆的理論基礎(chǔ)：細(xì)胞的全能性； 克隆的技術(shù)基礎(chǔ)包括：核移植技術(shù) 胚胎移植技術(shù)等。,1932年，英國作家赫胥黎在他的小說《美麗新世界》中預(yù)言，人類科技發(fā)展到足以復(fù)制自身之時，便是世界陷入混亂之日。    1938年，德國胚胎學(xué)家提出動物克隆的設(shè)想：

24、即從發(fā)育到后期的胚胎中取出細(xì)胞核，將其移植到一個卵子中去，使其繁殖。     1950年，首次在-79℃成功地冷藏牛的精于，稍后與母牛的卵子進行了人工授精。     1951年，科學(xué)家培育出第一個人體腫瘤細(xì)胞系。     1952年，皮科克醫(yī)生宣稱他找到了370多種不用精子生殖海膽的方法。  

25、0;  1952年，第一次進行動物克隆，羅伯特·布瑞格和托馬斯·金對小蝌蚪的細(xì)胞核進行無性繁殖。,1953年，沃森和克里克發(fā)表了震驚世界的千字論文，揭開了生命遺傳物質(zhì)即DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。     1962年，英國科學(xué)家約翰·戈德首次利用已長出腿的蝌蚪細(xì)胞進行克隆實驗。     1970年，英國科學(xué)家約翰

26、·戈德和同事利用經(jīng)過培養(yǎng)的成年青蛙表皮細(xì)胞核克隆成功成年青蛙。     1973年，科恩和博依將外來基因插入活的有機體的實驗取得突破性進展。     1976年，美國設(shè)立“重組DNA管理委員會”，負(fù)責(zé)管理人體基因工程。     1977年，數(shù)百名美國人來到美國國家科學(xué)院舉行示威，其口號是：“我們不要克隆

27、”，“不要碰我的基因”!這是第一次對生物技術(shù)提出抗議。     1978年，電影《來自巴西的男孩子》中一個假定的情節(jié)是：克隆了一群小希特勒。     1978年，由英國科學(xué)家史德彼逑和愛德華茲共同培育出第一個試管嬰兒--路易斯。,1978年，大衛(wèi)·羅文克在《他的影像》一書中斷言人類自身可以克隆。     

28、;1981年，日內(nèi)瓦大學(xué)的研究人員利用胚胎移植技術(shù)培育出正常的老鼠。     1982年，遺傳工程師布林斯特培育出一只含有人體生長基因的轉(zhuǎn)基因老鼠。     1983年，第一次成功地進行了人類胚胎由一個母體向另一個母體的轉(zhuǎn)移。     1985年，布林斯特第一次成功地創(chuàng)造了第一頭轉(zhuǎn)基因家畜--即幾頭能夠分泌人類生

29、長荷爾蒙的豬。     1986年，作為人工授精試驗的志愿者懷特·海德懷胎十月產(chǎn)下一女嬰，但當(dāng)她提出要撫養(yǎng) “自己的孩子”時，遭到了拒絕。     1986年，英國科學(xué)家首次利用胚胎細(xì)胞細(xì)胞核移植技術(shù)克隆出一頭羊。     1987年，美國里根政府將有關(guān)微生物專利注冊的規(guī)定，延伸到所有生物(包括動物)注

30、冊專利的規(guī)定。,1988年，格雷納德生物公司成功地利用改進型的細(xì)胞核移植技術(shù)來克隆奶牛。     1991年，美國國家衛(wèi)生與醫(yī)學(xué)博物館宣布，打算復(fù)制林肯身體組織樣本。     1991年，文特爾提出要對人體大腦中發(fā)現(xiàn)的337個基因擁有專利保護權(quán)和所有權(quán)。     1993年，電影《株羅紀(jì)公園》“克隆”了一大堆恐龍

31、。     1993年，人類胚胎克隆成功。     1994年，美國利用牛胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)克隆牛成功。     1994年，中國利用山羊胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)克隆山羊成功。     1996年，一部令人迷惑的電視動畫片《蜘蛛人》創(chuàng)造了一個克隆蜘蛛人的英雄形象。  

32、;   1997年，英國胚胎學(xué)家維爾穆特和他的同事宣稱用母羊的乳腺細(xì)胞克隆成功了第一只克隆羊。開創(chuàng)了成年哺乳動物克隆的先河。     1998年，克隆羊“多利”當(dāng)上了媽媽，生下了一只名叫“邦尼”的小羊。,動物克隆研究的三個階段 　根據(jù)供核體細(xì)胞的不同和生物技術(shù)的發(fā)展，可將動物克隆研究分為三個發(fā)展階段： 胚胎細(xì)胞克隆階段 1981年，IIImensee

33、和Hoppe報道他們用小鼠的正常囊胚或孤雌活化囊胚的內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞作為供核體，直接注入去掉雌雄原核的受精卵胞質(zhì)中，重構(gòu)胚體外發(fā)育到桑葚胚或囊胚后移植寄母子宮，獲得了克隆小鼠，這是在哺乳類第一次用胚胎細(xì)胞進行核移植獲得成功，1983年，美國科學(xué)家利用核移植技術(shù)結(jié)合細(xì)胞融合方法獲得了克隆小鼠，1986年，英國的Willadsen用綿羊的8－16細(xì)胞階段的胚胎細(xì)胞作供體進行核移植，首次應(yīng)用電融合的方法克隆出一只小羊。此后,其他科學(xué)家也相繼成功地

34、克隆出小鼠、綿羊、牛、兔豬和猴等。我國科學(xué)家也在20世紀(jì)90年代成功開展了胚胎細(xì)胞克隆兔、山羊、小鼠、牛和豬等研究。以上這些克隆實驗中所用供核細(xì)胞均屬發(fā)育至不同階段的胚胎細(xì)胞。,同種體細(xì)胞克隆階段 1997年2月，英國羅斯林研究所Wilmut等人宣布他們用6歲成年羊的高度分化的乳腺細(xì)胞進行了核移植，成功地獲得了克隆羊“多莉”。1998年5月，美國科學(xué)家Robl的研究組利用胎兒成纖維細(xì)胞克隆出了3頭牛，而且攜帶了轉(zhuǎn)移的基因。199

35、8年7月，日本科學(xué)家Dato等用牛的輸卵管細(xì)胞克隆出了8頭小牛。1998年7月，美國夏威夷大學(xué)Yanagimachi領(lǐng)導(dǎo)的研究小組獲得小鼠卵丘細(xì)胞進行克隆再克隆小鼠成功的結(jié)果。1999年6月，Yanagimachi的研究小組又利用成年雄性小鼠尾尖的成纖維細(xì)胞為供核體細(xì)胞成功地克隆出了一只雄性小鼠，這也是第一只供體細(xì)胞不是來源于雌性動物被克隆的動物。此后，同種體細(xì)胞克隆山羊、豬、貓和兔也都相繼誕生。我國體細(xì)胞克隆山羊和克隆牛不論雌的還是雄

36、的也都已獲得成功。在同種體細(xì)胞克隆研究中。所用供核體細(xì)胞為高度分化的體細(xì)胞。,異種體細(xì)胞克隆階段 異種體細(xì)胞克隆是將一種動物的體細(xì)胞核移植到另一種動物的去核（遺傳物質(zhì)）卵母細(xì)胞中。 由于瀕危物種的個體數(shù)量少，很難提供用于克隆的卵母細(xì)胞和代孕受體，這就促使科學(xué)家提出了異種克隆的設(shè)想。 異種克隆研究面臨著許多問題，如體細(xì)胞核能否在異種卵胞質(zhì)中去分化并支持早期胚泡發(fā)育？異種核質(zhì)能否相容？異種重構(gòu)胚能否著床并進行全程發(fā)育

37、等問題。 1999年，中科院動物所實驗室將成年大熊貓體細(xì)胞作為供核體細(xì)胞移植到去核（遺傳生物）日本大耳白兔卵母細(xì)胞中成功地構(gòu)建異種重構(gòu)胚，體外培養(yǎng)獲得孵化囊胚。2001年將重構(gòu)胚移植寄母子宮，獲得了著床的重大進展。2002年，不僅異種重構(gòu)胚能夠在異種寄母子宮中著床，而且還能發(fā)育，這是異種克隆大熊貓研究中攻克的最后一個難題中的最新進展。,明代吳承恩：《西游記》 1932年赫胥黎（英國） 《美麗的新世界》 1978年

38、，美國《按照他的面貌：克隆一個人》（The Cloning of a man）。戴維.羅維克（David Rorvik），！ 神話→科幻→現(xiàn)實 通向“多莉”之路——哺乳動物的克隆史 魏斯曼（August Weismann）是最初解釋胚胎發(fā)育的德國科學(xué)家。中心思想是：一旦受精卵第一次分裂，形成兩細(xì)胞胚

39、胎時遺傳信息便開始消減了！細(xì)胞的分化是由于通過細(xì)胞的分裂，遺傳物質(zhì)（基因）丟失的原因。 博韋理（Theodor Boveri）,德國細(xì)胞學(xué)家，發(fā)現(xiàn)馬蛔蟲的染色體消減現(xiàn)象。,W.魯（Wilhelm Roux）,德國胚胎學(xué)家，金線蛙卵的針燙實驗。 德里斯（Driesch），海膽卵的震蕩實驗。 漢斯.施佩曼（Hans Spemann）德國大胚胎學(xué)家。1902年進行了蠑螈結(jié)扎實驗。1928年進行了首次

40、核移植實驗。他的工作促使世界各國科學(xué)家開始了克隆動物的征程。 布里格斯（Briggs）和托馬斯.金(Thomas J. King)，美國哈佛大學(xué)。 1952年進行北方豹蛙核移植實驗，先后獲得了蝌蚪和成體蛙。（用胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞核獲得克隆蛙，但利用分化細(xì)胞、種間細(xì)胞未獲成功）。,20世紀(jì)50年代前的工作結(jié)論：克隆胚胎細(xì)胞能發(fā)育到成體蛙，克隆成體蛙細(xì)胞能發(fā)育到蝌蚪，沒有人能做出每個人都期待的關(guān)鍵實驗——從成體蛙的細(xì)胞克隆

41、出一只成體蛙?。ǚ只?xì)胞發(fā)育的局限性和種間核移植的局限性） 約翰.格登（John Gurdon）,英國牛津大學(xué)發(fā)育生物學(xué)家。1962年利用非洲爪蟾（蝌蚪）的腸細(xì)胞核移植實驗。成功的克隆出一只成體蛙。（說明已分化的細(xì)胞核進行核移植成功，打破了細(xì)胞發(fā)育的局限性）。 童第周，實驗胚胎學(xué)家。1963年，從事克隆魚的研究，證實了不同種的生物間（鯉魚和鯽魚）也可成功進行核移植，打破了物種之間的禁區(qū)。70年代黑斑蛙的紅細(xì)胞

42、核移植實驗。 1981年，我國武漢水生生物研究所的科研人員，利用腎臟細(xì)胞克隆出世界上第一條克隆鯽魚。首次證明了成年細(xì)胞也可以去分化和再程序化，可惜當(dāng)時沒有得到更多的認(rèn)可。,1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)的卡爾伊爾門澤和美國的杰克遜實驗室首瓷對小鼠進行移核實驗。他們將囊胚內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞的核移入去核的受精卵中，獲得核移植克隆鼠，這是首次報道克隆哺乳動物成功的例子。 自開展哺乳動物的克隆以來，世界各國都作出了出色的卓有成效的工作

43、。 1984年，維拉達森（Willadson），英國劍橋大學(xué)生殖生物學(xué)家。成功的把羊的8細(xì)胞胚胎的核轉(zhuǎn)移到未受精的去核卵中，得到真正的克隆哺乳動物——克隆羊。 1986年，維拉達森又成功的克隆出牛。,1991年，西北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得5只克隆山羊； 1992年，江蘇省農(nóng)科院，中科院發(fā)育所、分別報道得到了“克隆兔”。 1993年，我國臺灣得到5頭“克隆豬”。 1994年，美國科學(xué)家菲兒斯特得到

44、了“克隆?！薄ｋS后，我國華南師范大學(xué)、中科院畜牧所也得到“克隆?！?。 1996年，美國用核移植的辦法得到了3只“克隆猴”。 目前，已克隆的哺乳動物有小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛、猴等。,美國（1952年前）→英國（1963年）→中國（1970年前后）→英國 第一階段 第二階段 第三階段,動物克隆史上的豐碑——“多莉”的誕生（體細(xì)胞的克?。?

45、 1997.2.27，英國《Nature》刊登“來自胎兒和成年乳腺細(xì)胞的成活后代”文章，報道了蘇格蘭愛丁堡的羅斯林（Roslin）研究所維爾穆特（Wilmut）的出色工作，實現(xiàn)了哺乳動物體細(xì)胞的克??！ 1996.7.5，利用克隆技術(shù)培育出世界上第一只只有母親，沒有父親的哺乳動物——“多莉”（Dolly）小綿羊誕生了。 Wilmut在克隆“多莉”時，同時做了三種細(xì)胞：來自9天的胚胎細(xì)胞；26天的胎兒分化

46、皮膚細(xì)胞；凍存的成體（6歲）乳腺上皮細(xì)胞，都分別獲得了后代。最引人注目的是6歲母羊乳腺上皮細(xì)胞的克隆成功！ 移植277個乳腺上皮細(xì)胞，獲得29個胚胎（桑椹期或囊胚期），移植到代孕母羊的子宮中，最后產(chǎn)下一只小羊——“多莉”,芬多席特白面羊（6歲）,蘇格蘭黑面羊,乳腺上皮細(xì)胞（凍存3個月）,卵細(xì)胞,細(xì)胞核,取出細(xì)胞核,去核卵,換核卵細(xì)胞,體外培養(yǎng),代孕母羊,“多莉”（白面羊的復(fù)制品）,,,,,,,,,克隆綿羊“多利”沒有父

47、親，卻有三位母親。整個克隆過程如下： 首先，科學(xué)家從一只產(chǎn)自芬蘭的6歲成年多塞特母綿羊A（“多利”的親生母親）的乳腺中取出一個本身并沒有繁殖能力的普通細(xì)胞，將這個細(xì)胞的基因分離出來備用。 然后，科學(xué)家在取出另一只母綿羊B（“多利”的借卵母親）的未受精的卵細(xì)胞，將這個卵細(xì)胞中的基因取出，換上母綿羊B的乳腺細(xì)胞的基因，形成一個含有新遺傳物質(zhì)的卵細(xì)胞，再將這個基因已被“調(diào)包”的卵細(xì)胞放電激活，促使它分裂發(fā)育成胚胎。

48、最后，當(dāng)胚胎生長到一定程度時，將它植入第三只母綿羊C（“多利”的代孕母親）的子宮中，經(jīng)過正常的妊娠產(chǎn)下“多利”。 　多利完全繼承了其親生母親――多塞特母綿羊的全部DNA基因特征，是多塞特母綿羊百分之百的“復(fù)制品”。,☆Wilmut克隆“多莉”的生物學(xué)意義及幾個關(guān)鍵問題,△具有豐富的保存卵細(xì)胞和其它細(xì)胞的經(jīng)驗,△掌握了熟練的核移植．等關(guān)鍵性技術(shù),△對受精卵進行了電刺激處理，起激活作用,△采用細(xì)胞同步化技術(shù)，使受體和供體細(xì)胞均處在細(xì)胞周期

49、的G0期,△已經(jīng)成功的進行了先期克隆實驗,1976年3月7日，Wilmut就在《Nature》報道了利用羊的胚胎細(xì)胞克隆出兩只雙生羊——麥根（Megan）和莫龍格（Moroag）,‘多莉’的誕生激勵各國科學(xué)家進一步研究哺乳動物的克隆問題。 1997年，先后得到克隆羊、克隆牛等。 1998年7月，一組科學(xué)家（日、美、英、意）在美國檀香山宣布：他們已經(jīng)用經(jīng)卵泡細(xì)胞的細(xì)胞核克隆成功的小鼠“卡紐麗娜”再克隆出下

50、一代，祖孫三代50只克隆鼠組成的大家庭具有完全一致的遺傳基礎(chǔ)。（成功率達到2%，被稱為“檀香山技術(shù)”）。 1998年3月，法國得到克隆?！R格麗特“ 4月，新西蘭得到克隆?！凹?5月，美國得到克隆?！皢讨巍焙汀安闋査埂?10月，中國杜淼獲胎兒成纖維細(xì)胞克隆山羊 1998年底，《科學(xué)》報道德國科學(xué)家得到成年牛卵丘細(xì)胞和輸

51、卵管上皮細(xì)胞 “克隆牛”。 1999年元旦剛過，在日本北海道降生了一頭用耳細(xì)胞核克隆的良種奶牛。,2000年1月，美籍華人楊向忠利用體外培養(yǎng)的公牛耳皮細(xì)胞成功克隆出6頭牛犢。打破了科學(xué)界認(rèn)為只有利用新鮮或短期培養(yǎng)的細(xì)胞才能克隆的傳統(tǒng)觀念。 2000年1月，《科學(xué)》報道第一個靈長目動物——恒河猴被克隆。 2001年11月3日，我國首例健康成活的胎兒皮膚細(xì)胞克隆?！翱悼怠薄?001年11月6日

52、，同樣用牛胎兒皮膚上皮細(xì)胞核克隆出“雙雙”在萊陽農(nóng)學(xué)院誕生。 2002年1月18日，中國第一頭本土克隆?！拔痹诓芸h通過剖腹產(chǎn)誕生，不久死去。,2002年2月11日，中科院動物所陳大元和曹縣五里墩中大動物胚胎工程中心聯(lián)手利用成年體細(xì)胞克隆牛群體成功。（優(yōu)質(zhì)成年牛的耳成纖維細(xì)胞核，共產(chǎn)14只，存活5頭） 綜上所述可見：幾個世紀(jì)以來人類夢寐以求的快速、大量繁殖純種動物的夙愿，在世紀(jì)之交已變成了現(xiàn)

53、實。 我國科學(xué)家自1998年宣布了雄心勃勃的異種借腹克隆大熊貓的計劃，目前中科院的陳大元研究員將大熊貓的體細(xì)胞核植入去核兔卵中，已成功的在體外培育出了大熊貓胚胎，進一步攻克的防線和難關(guān)是胚胎的異種著床。,（四）克隆的技術(shù)方法及制備程序 主要指以細(xì)胞核移植為核心技術(shù)的無性繁殖技術(shù)。1 細(xì)胞核移植技術(shù) ★概念及發(fā)展史 是一種利用顯微操作技術(shù)將一種動物的細(xì)胞核移入同種或異種動物的去核成熟卵內(nèi)的精細(xì)操作技術(shù)。

54、包括胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植兩種。通過此技術(shù)可獲得核質(zhì)雜種。,利用核移植技術(shù)，可以研究胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的功能及相互作用關(guān)系；探索有關(guān)遺傳、發(fā)育和細(xì)胞分化等方面的理論等問題，后來才將此技術(shù)應(yīng)用于克隆。,1928年，德國胚胎學(xué)家施佩曼（Hans Spemann）第一個提出細(xì)胞核移植的設(shè)想并進行了首次核移植實驗的嘗試。他的工作促使世界各國科學(xué)家開始了克隆動物的征程。 1952年，布里格斯（Briggs）和托馬斯.金(

55、Thomas J. King)，美國哈佛大學(xué)。 進行北方豹蛙核移植實驗，先后獲得了蝌蚪和成體蛙。（用胚胎發(fā)育早期的細(xì)胞核獲得克隆蛙，但利用分化細(xì)胞、種間細(xì)胞未獲成功）。 1958-1962年間，英國劍橋大學(xué)利用爪蟾原腸內(nèi)胚層細(xì)胞核移植，培育出可育非洲爪蟾。 1977年，開始在小鼠進行哺乳動物的核移植，并先后取得了突破性進展。 我國的核移植實驗開始于20世紀(jì)50年代。著名科學(xué)家童第周先后在兩棲類和魚類做出了在世界

56、上極有影響的工作，特別是他同牛滿江合作，實現(xiàn)了不同種間的核移植，成功地?zé)o性繁殖了“鯉鯽核魚”。（鯽魚核→鯉魚去核卵中）,2 細(xì)胞核移植的技術(shù)要點 核移植的眾多工作為后來的動物克隆打下了良好的基礎(chǔ)。下面簡要說明細(xì)胞核移植的技術(shù)要點： （1）受體體細(xì)胞的準(zhǔn)備 受體為成熟的卵細(xì)胞。采用機械法（剝離）或化學(xué)法（胰蛋白酶）去卵膜，然后用玻璃微針挑出細(xì)胞核或紫外線照射使核物質(zhì)分解以達到去核的目的。 （2） 供體細(xì)胞的

57、準(zhǔn)備 供體通常選用： 胚胎細(xì)胞——發(fā)育至32-64個卵裂球的胚胎細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞——來自胚胎內(nèi)細(xì)胞團 成年動物體細(xì)胞 其共同的特性是細(xì)胞核具有全能性。,（3）移核 選擇合適的微吸管穿過透明帶注入去核卵母細(xì)胞中，避免移入過多的細(xì)胞質(zhì)、控制溫度，短時間內(nèi)完成。還可用供核細(xì)胞和卵母細(xì)胞的融合實現(xiàn)核轉(zhuǎn)移。 （4）融合和激活 融合是指用某種方法使核與胞質(zhì)融為一體的過程；

58、 激活是通過某種刺激使卵子內(nèi)鈣離子濃度升高，給卵一個啟動信號，促使細(xì)胞周期的恢復(fù)。,3 克隆動物的制備程序,核供體動物的選擇與細(xì)胞核的獲得,核受體動物的選擇與細(xì)胞核的移出,供體核的移入及原核的取出,胚泡的體外試管培養(yǎng),代母的選擇與胚泡移入子宮,克隆動物的體內(nèi)發(fā)育與出生,,,,,,,根據(jù)細(xì)胞核的來源不同，一般分為胚胎細(xì)胞核移植法、胚胎干細(xì)胞移植法、胎兒成纖維細(xì)胞移植法和體細(xì)胞核移植法，其基本程序大體一致。,1）胚胎細(xì)胞核移植法

59、 將未著床的早期胚胎分散成單個細(xì)胞，然后分別取核進行核移植，發(fā)育成胚胎后再行胚胎移植、發(fā)育分娩。也可通過細(xì)胞融合法將供體核移入去核卵的方法。2）胚胎干細(xì)胞移植 首先制作胚胎干細(xì)胞系，再進行細(xì)胞核移植，可克隆出更多的動物個體。此法在小鼠較為成熟。3）胎兒成纖維細(xì)胞核移植 從早期胎兒分離成纖維細(xì)胞進行核移植。 1998年5月，美國科學(xué)家Robl的研究組利用胎兒成纖維細(xì)胞克隆出了3頭牛，而且攜帶了轉(zhuǎn)移的基因。,,

60、4）體細(xì)胞克隆技術(shù) 1997年2月，英國羅斯林研究所Wilmut等人宣布他們用6歲成年羊的高度分化的乳腺細(xì)胞進行了核移植，成功地獲得了克隆羊“多莉”。榮登Science雜志評出的1997年世界十大科技成就之首。,芬多席特白面羊（6歲）,蘇格蘭黑面羊,乳腺上皮細(xì)胞（凍存3個月）,卵細(xì)胞,細(xì)胞核,取出細(xì)胞核,去核卵,換核卵細(xì)胞,體外培養(yǎng),代孕母羊,“多莉”（白面羊的復(fù)制品）,,,,,,,,,,☆遺傳素質(zhì)完全一致的克隆動物將有利于開展

61、對動物（人） 生長發(fā)育、衰老和疾病健康等機理的研究,☆拯救瀕臨滅絕的動物（異種克隆、借腹懷胎），保護基因資源,☆大量快速擴大和繁殖高經(jīng)濟性狀（品質(zhì)優(yōu)良）的牲畜（禽）,☆克隆轉(zhuǎn)基因動物，創(chuàng)建活的藥廠，提供廉價的藥品和保健品,☆提高臨床醫(yī)學(xué)的治療手段（提供易被接受的移植器官）,☆解決不育癥，作為生育的輔助措施——“克隆人”,☆DNA大量拷貝（DNA 克?。?（五）克隆技術(shù)的實踐應(yīng)用及意義,動物克隆的廣泛開展，進一步驗證了細(xì)胞的全能

62、性,,克隆技術(shù)最重要的用途體現(xiàn)在兩方面：一是大規(guī)模繁殖良種動物，包括轉(zhuǎn)基因動物；二是克隆瀕危動物。前者，可生產(chǎn)基因藥物。伊恩·威爾莫特在克隆多利之前，先從英國PPL基因工程公司得到了一批轉(zhuǎn)基因羊，這種羊的基因中帶有人體的一個功能性基因，并在母羊的乳腺中表達出來。 克隆瀕危動物，最典型的例子就是大熊貓。現(xiàn)在大熊貓總數(shù)只有1000頭左右，因其數(shù)量非常有限，因此用大熊貓的卵細(xì)胞克隆不現(xiàn)實。有科學(xué)家提出了“異體克隆”，即大

63、熊貓的體細(xì)胞和兔子的卵細(xì)胞克隆，但這項工作目前進行得比較艱難，國內(nèi)科學(xué)家正努力將這一研究進行下去。,,（六） 克隆技術(shù)存在的問題（克隆留給我們的思考） ☆ 技術(shù)尚不成熟，成本高、效率及成活率低,移植434只成體綿羊的乳腺上皮細(xì)胞核至相同數(shù)量的綿羊卵子中，產(chǎn)生了277個融合細(xì)胞（成功率為63.8%）。 將此融合細(xì)胞移入母羊輸卵管成功247個（89.2%），只獲得29個發(fā)育到桑椹期或囊胚期的胚胎11.7%）。

64、 移植到13只代孕母羊的子宮中，僅有一頭羊懷胎（7.7%）最后產(chǎn)下一只小羊——“多莉”(總成功率為0.23%)。,☆存在嚴(yán)重的生理或免疫缺陷 ☆ 克隆動物的壽命問題，克隆動物存在嚴(yán)重的早衰問題，夭折率高達75%。（多莉DNA遭損傷，明顯衰老，端粒比同齡羊縮短約20%，與6歲供體核母羊相似）,關(guān)于克隆動物是否早衰的爭論大體分兩派，一派認(rèn)為，克隆動物的端粒比較短，克隆動物的基因不正常，克隆動物早衰是一個根本

65、現(xiàn)象。另一派則認(rèn)為，克隆動物的遺傳物質(zhì)是正常的，目前發(fā)現(xiàn)的早衰跡象是在克隆過程中出現(xiàn)的一些技術(shù)問題造成的，或者克隆動物在發(fā)育中出現(xiàn)了變異，早衰只是屬偶然現(xiàn)象，也許有的變異使得克隆動物更加長壽。不過由于目前全世界的克隆動物較少，誕生時間都不很長，因此到目前為止這一問題尚未有定論。,“多利的早死，早就預(yù)料到了” 2003年2月14日，培育出多利的英國蘇格蘭羅斯林研究所發(fā)表新聞公報說，由于獸醫(yī)檢查發(fā)現(xiàn)多利患有進行性肺病，研究人員對它實

66、施了“安樂死”。進行性疾病系指癥狀不斷加重、狀況不斷惡化的疾病。 “多利的早死，早就預(yù)料到了！”專家們?nèi)缡钦f。生物壽命由基因密碼決定，但多利是通過體細(xì)胞移植進行無性繁殖的產(chǎn)物，其基因是一成不變的。比如，一個人自然壽命是120年，如果拿一個50歲的人的體細(xì)胞克隆，其后代的自然壽命就會減去50歲而縮短到70年。多利3歲時做了一次基因組檢測，發(fā)現(xiàn)染色體端粒長度比正常羊短20％，而端?？s短是衰老的標(biāo)志。根據(jù)染色體長度推算下來，多利3歲時

67、的衰老程度與其“代理母親”9歲時一樣。此外，在進行克隆操作的時候，基因會不可避免地受到損傷，這就導(dǎo)致克隆動物免疫上的先天缺陷?；谶@樣的分析，專家認(rèn)為多利的早死是必然的。,☆ 克隆動物和原來一樣嗎（是否是完全的復(fù)制？） ☆ 受體細(xì)胞的選擇問題（卵細(xì)胞以外的細(xì)胞可以嗎？） ☆ 恐龍可以被克隆嗎？（恐龍細(xì)胞核、卵、代孕母親） ☆ 社會學(xué)、倫理學(xué)問題——克隆人,,1 克隆人爭論的由來

68、 2 克隆人可能嗎？ 3 能克隆出一個正常人嗎？ 4 克隆人的社會地位（處境）如何？ 5 世界各國的態(tài)度及我國立場,（七）驚世駭俗的計劃——“克隆人”,,1997年克隆綿羊“多莉”后引發(fā)出的對克隆人的思考和顧慮，并激起了各國政府的強烈反響。 自從2003年邪教組織雷爾教派的科學(xué)家布里吉特·布瓦瑟利耶聲稱已“培育出世界第一個克隆嬰兒”后，國際輿論

69、一直沸沸揚揚，科學(xué)界則始終持質(zhì)疑的態(tài)度。然而，由此引發(fā)的“克隆人”熱卻至今溫度不減。 多數(shù)西方國家政府，領(lǐng)袖以及宗教界人士紛紛發(fā)表聲明反對克隆人，也有不少國家制定了禁止克隆人的法令。在這種情況下，依然在國際社會還有人要進行克隆人。 如意大利婦科專家安蒂諾利，美國專家扎沃斯，還有在美國的法國女科學(xué)家布利吉特，布瓦瑟利耶。她在2002年12月27日于美國佛羅里達州宣布“26日世界上第一個‘克隆人’誕生了”，除了人們的震驚外

70、，緊接著是一片質(zhì)疑和反對聲。,1998年新年伊始，美國一位物理學(xué)家公開向新聞媒體宣布了他自己輝煌的“克隆人”計劃。此人名叫理查德.錫德，70歲，哈佛大學(xué)教授， 意大利胚胎學(xué)家安蒂諾里和美國一女科學(xué)家，已經(jīng)征集了200多位女性在公海的一只游船上進行克隆人的試驗。 英國和韓國已于1998年用人的體細(xì)胞克隆成功人的胚胎，由于法律約束又銷毀了。 維爾穆特1999年月初在英國宣布他領(lǐng)導(dǎo)的

71、科研小組正著手實施克隆人體胚胎的計劃。 1999年6月，美國馬薩諸州成功克隆出人的胚胎。,2001年11月25日美國先進細(xì)胞技術(shù)公司（ACT）報道了利用克隆技術(shù)培育出人類早期胚胎（4、6細(xì)胞期），這個消息一瞬間就傳遍了世界，在全球引發(fā)軒然大波，激起了各國爭議，因為它離克隆人只有一步之遙。 因為構(gòu)建成的胚胎只要移入婦女子宮，就有可能發(fā)育成個體（即克隆人），它比治療性克隆技術(shù)的復(fù)雜程序要簡單得多。因此，人們十分擔(dān)心