1、1,白血病/淋巴瘤免疫分型,2,流式細胞術的基本概念,流式細胞術（Flow Cytometry, 簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細胞）的多項特性的技術，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征，并加以定量,3,散射光信號和熒光信號,前向角散射光（FSC, Forward Scatter）入射激光的前向散射光信號

2、細胞相對大小及其表面積側向角散射光（SSC, Side Scatter）入射激光90?角的散射光信號細胞粒度及細胞內相對復雜性熒光素與特異抗體結合，熒光抗體與細胞抗原結合越多，產生的熒光信號越強。,4,CD45/SS示意圖,5,實驗對照的設計,空白對照：ALL陰性對照：常用同型抗體對照 單色分析：設同型抗體對照 多色分析：同型對照，單陽性對照（用于儀器校正）陽性對照：檢測陰性時,6,空白對照和陰性對照的

3、比較：,7,,需要用多少的標志來確證感興趣的細胞群?它們在細胞上的分布是不是很近?它們是否在不同的細胞上表達不同?他們表達強還是弱?,抗原表達,,,,,CD3,CD4,8,抗原分布,表面,胞漿,核內是共同檢測還是分別檢測?,CD3,4,8, tetramer+Cytokines,CD3,4,8, tetramer+DNA,Cytokines+DNA,CD3,4,8, tetramer+Cytokines+DN

4、A,,9,設門,08-03307,10,設門,全部 細胞,門內細胞,08-03307,11,12,13,血液腫瘤分類進程,14,目前最完善的血液腫瘤免疫分型文獻,15,白血病免疫分型的理論基礎,白血病/淋巴瘤免疫分型采用的抗原標志是表達于正常造血細胞不同分化發(fā)育階段的分化抗原。雖然是惡性腫瘤細胞，但仍能表達正常血細胞所具有的抗原，因而仍可依據其抗原的表達譜對白血病/淋巴瘤進行免疫分型。為了正確分析白血病/淋巴瘤細胞，必須對正常造血細胞分

5、化抗原的表達模式有充分的了解。只有熟悉正常細胞的抗原表達模式，才能辨認白血病/淋巴瘤細胞的存在。,16,細胞類型鑒定,,,Borowitz et al (1993) AJCP 100:534-40.Steltzer et al (1993) Ann NY Acad Sci 667:265-280,17,CD45/SS示意圖,正常骨髓細胞 血液腫瘤細胞老化粒細胞 、噬酸細胞 早

6、幼—成熟粒細胞 M3、CML單核細胞 M4、M5 LGL淋巴細胞 CLL、ALL、CLD正常前體細胞 M0、M1、M2

7、、 嗜堿性粒細胞 M4、M5、ALL成熟紅細胞、血小板 M6、M7、MM細胞碎片 Pre-B-ALL 非血液來源細胞,,,,,,,,,,,,,18,B淋巴細胞分化與抗原表達關系圖,Wood and Borowit

8、z (2019) Henry’s Laboratory Medicine,19,T淋巴細胞分化與抗原表達關系圖,Wood and Borowitz (2019) Henry’s Laboratory Medicine,20,粒細胞分化與抗原表達關系圖,Wood and Borowitz (2019) Henry’s Laboratory Medicine,21,單核細胞分化與抗原表達關系圖,Wood and Borowitz (2019

9、) Henry’s Laboratory Medicine,22,非腫瘤T淋巴細胞表型,23,非腫瘤B淋巴細胞表型,24,非腫瘤粒細胞、單核細胞表型,25,非腫瘤粒細胞、單核細胞表型,26,白血病免疫分型,根據白血病細胞表達的系列相關抗原，確定其系列來源。如：淋系T/B、粒單系、紅系、巨核系等。根據白血病細胞表達的系列分化其相關抗原進一步分型。如：早前B，前B，普通B…,27,EGIL，2019年白血病積分系統(tǒng),分值

10、 B系 T系 髓系 2 CD79a CD3 MPO (cyt)CD22 TCRα/β (cyt)IgM TCRγ/δ1 CD19 CD2 CD1

11、17 CD20 CD5 CD13 CD10 CD8 CD33 CD10 CD650.5 TdT TdT

12、 CD14 CD24 CD7 CD15 CD1a CD64*當髓系和一個淋系積分均>2分時，則診斷為急性混合細胞型白血病。,,,,28,急性白血病的四大免疫類型,單表型急性白血病表達某一個系列抗原為主的急性白血病

13、雙表型/雙克隆急性白血病未分化型急性白血病,29,初治急白分型,Acute Leukemia – Blasts Present >20%,,,,紅系和巨核系的鑒定需要另外增加二線抗體。如:CD71、GPA、CD41、CD61,30,AML-M1,31,,AML-M1,32,AML-M2,33,AML-M2,34,AML-M3,35,AML-M4,36,AML-M4,37,AML-M5,38,AML-M6,39,初治急淋分型,

14、,,,CommonThymocyte,MatureThymocyte,CD2+CD5+Dual CD4+/CD8+sCD3-,CD2+CD5+CD4+ or CD8+sCD3+,CD2-/+CD5-/+sCD3-CD4-CD8-,TdT+CD10-clg-sig-,Pre-B,CD10+cig+TdT+sig-,B,sig+CD10+/-clg+/-TdT-,Common,TdT+CD10+

15、clg-sig-,EarlyThymocyte,,,,Early B-Precursor,,40,B細胞系ALL的免疫分型 亞型 CD19 CD20 HLA-DR CD10 CyIg SmIg FAB分型早前B-ALL + — + — — — L1,L2 前 B-ALL + —/+

16、 + + + — L1普通B-ALL + +/ — + + — — L1,L2成熟B-ALL + + + +/ — —/+ + L3,,,,41,B-ALL,42,Pre-BALL,43,Common-B-ALL,44,,T細胞系ALL的

17、免疫分型 亞型 CD7 CD1a CD2 TdT FAB分型早前T-ALL + — — + L1,L2胸腺皮質T-ALL + + + + L1,L2 T-ALL + — +

18、+ L1,L2,,,,45,T-ALL,46,T-ALL,47,HAL（T/M雙克?。?48,49,,白血病免疫分型的價值,確定ALL的細胞類型（B細胞或T細胞）和 ALL的分化階段。鑒定AML的特征。對形態(tài)學上未分化的急性白血病有助于鑒定細胞類型。診斷一些少見類型的白血病。如：M6、M7、M0等。,50,,診斷雙表型/混合細胞型急性白血病。鑒別診斷ALL伴有髓系抗原表達（My+）或AML伴有淋系抗原表達（

19、Ly+）。鑒別急性白血病與其他造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)惡性腫瘤。根據一些特殊的免疫表型特征診斷與某核型異常相關的亞型。如：M3/t(15;17); M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。,51,淋巴瘤免疫分型,非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)是淋巴系統(tǒng)的一類具有組織和生物學異質性的惡性克隆性疾病。世界衛(wèi)生組織（WHO）結合形態(tài)學、免疫表型、基因分型、正常細胞組成及臨床行為，，新修訂了歐美

20、淋巴瘤分類系統(tǒng)（REAL分類）對淋巴系統(tǒng)腫瘤的分類。這種分類方法在觀察者的組內及組間的重復率為85-95%。WHO淋巴瘤分類是建立在疾病病理形態(tài)、免疫表型、遺傳學特征、臨床特點的綜合資料基礎上：病理形態(tài)是分類的基礎，大多數淋巴瘤僅靠病理形態(tài)就能做出明確診斷；免疫表型和遺傳學特征是確定每一淋巴瘤的重要指標，是達成共識的客觀依據，有助于提高診斷的可重復性，具有鑒別診斷和預后判斷的輔助作用，但在淋巴瘤診斷中并非必不可少；臨床特點，特別是腫瘤原

21、發(fā)部位，如節(jié)內或節(jié)外（皮膚、中樞神經、胃腸、縱膈、鼻腔），是確定某些淋巴瘤的重要指標。雖然定義淋巴瘤是綜合考慮的結果，但在具體確定一種淋巴瘤時其側重點有所不同。,52,淋巴瘤病理分類的演進形態(tài)學（Kiel分期）形態(tài)學加臨床特點(IWF) 形態(tài)學、免疫表型、遺傳特點和臨床特點(REAL WHO分類）,,,,53,WHO認為，淋巴細胞性白血病和淋巴瘤為同一種疾?。簜鹘y(tǒng)上淋巴瘤和白血病是兩種不同的疾病，現在從形態(tài)、

22、免疫和遺傳學來看，淋巴瘤和白血病是同一疾病的不同時相（瘤體期或彌散期/循環(huán)期），將它們分開純粹是人為的。淋巴瘤的臨床行為決定了臨床工作中的治療策略，WHO分類系統(tǒng)更多的采用與生物學特點相關的淋巴瘤診斷和分類方法，基于淋巴瘤的免疫和分子生物學特點的治療方法也不斷涌現，這些在將來會大大提高針對淋巴瘤的不同特點進行的治療。,54,淋巴瘤免疫分型意義,淋巴瘤免疫分型可以區(qū)分反應性與瘤性細胞：活檢、細針穿刺與體液標本均可；確定腫瘤細胞的系列：T、

23、B、組織細胞、髓系、非造血系。分類中根據免疫表型和DNA含量，可確定低、中、高度惡性程度。區(qū)別不同類型腫瘤細胞：伯基特細胞，淋巴母細胞，濾泡型細胞（小細胞混合和/或大細胞），小淋巴細胞，套細胞，彌散小細胞或大細胞，免疫母細胞。確定淋巴瘤的分期：檢測有否血液、骨髓和體液的累及。疾病監(jiān)測：微小殘留病的監(jiān)測，判斷療效（血液、骨髓、細針穿刺標本），確定瘤細胞表型變化，監(jiān)測Retuximab(抗CD20)治療前后的CD20定量變化，自體干細胞移植

24、中干細胞收獲時的瘤細胞檢測等等.,55,淋系腫瘤WHO分類,56,淋巴瘤診斷的必查項目,根據淋巴結或骨髓活檢進行診斷,至少需要對一個腫瘤組織的石蠟塊的所有切片進行血液病理學檢查.如果認為樣本組織不能確診,則需要重新活檢。腫塊細針穿刺（FNA）不宜作為淋巴瘤初始診斷的依據。但是在某些情況下，FNA結合細胞形態(tài)學和流式細胞學檢查也可以為診斷提供足夠的信息，特別是在診斷CLL時。某些情況下還需要進行免疫組化、分子/細胞遺傳學檢查。,57,

25、流式細胞術檢測到的成熟淋巴細胞常見異常表型,淋巴細胞某一亞群的擴增 異?？乖磉_——高/低/缺失/異常共表達 細胞形態(tài)增大,58,,,淋巴細胞,正常淋巴細胞,淋巴細胞增殖性疾?。寺U增）,59,B 細胞可隆性的確定是通過檢測證實所以B細胞僅表達一種輕鏈或重鏈:Light chains: “kappa” or “l(fā)ambda”Heavy chains: IgG, IgA, IgM,60,B細胞的不同克隆性表達,Norm

26、al: k 50; λ 39,k 2; λ 98 +,k 3; λ 93 +,k 86 ?; λ <1,k 1; λ 99,k 5; λ 84 +?,k 99+; λ 1,K99+?;λ 1,61,慢性淋巴細胞增殖性疾病 （Chronic Lymphoproliferative Disease）,CLL來源于B細胞，具有免疫球蛋白重鏈或輕鏈基因重排，CLL細胞主要為較正常淋巴細胞稍大的小淋巴細胞。免疫分型主要為：SIgM、SI

27、gD弱表達，B系抗原為CD19、CD20、CD23、CD79a與CD5共表達。而CD38,ZAP-70,Ki67等抗原的表達與CLL預后有密切關系。CLL與其它某些淋巴瘤在形態(tài)學上相似，但在免疫表型上卻各有特點。,62,慢淋和B淋巴瘤分類,CLL and Non-Hodgkins Lymphoma,,CD5-,CD10-,CD10+,Follicular Cell Or Burkitt’s Lymphoma,SLVL or M

28、arginal Zone LymphomaorHairy Cell Leukemia,,,,,,CD5+,B-CLLorMantle Cell Lymphoma,,MCL：t(11;14)；NCCN要求對所有CLL患者檢測t(11;14)或CCND1表達,63,ALL/CLL?,64,評估CLD的抗體,First: CD5,CD19,kappa,lamda 　　CD3,CD20,CD23,CD10,CD

29、45B-cell:CD22,FMC7,CD11c,CD103 CD38,CD25,CD79b,heavychain (約12-15Ab)T-cell:CD4,CD7,CD8,CD2,CD56 CD16, TCRα/β，TCRγ/δ特殊用途: CD30,bcl-2,TdT　 　CD1a,CD34,CD71Total:約12-16個Ａb,6

30、5,B-CLL與類似淋巴瘤的免疫表型,Antigen B-CLL HCL Mantle Cell Lymphoma SLVL Follocular LymphomaSIg +/- + ++ ++ ++CD5 ++ — ++

31、 — —CD19 ++ ++ ++ ++ ++CD20 + — ++ ++ ++CD22 +/- ++

32、 ++ ++ ++CD23 ++ — — — —CD79b +/- ++ ++ ++ ++FMC-7

33、 — — ++ ++ ++CD10 — — — — ++CD103 — ++ — —

34、 —CD25 + ++ — _ +/- —CD11c +/- ++ — +/- —Antigen：抗原；SIg：膜免疫球蛋白；B-CLL：B慢淋；HCL：毛細胞型白血病

35、；Mantle Cell Lymphoma：套狀淋巴瘤：SLVL：絨毛樣脾淋巴瘤：Follocular Lymphoma：濾泡型淋巴瘤,,,,66,濾泡中心B細胞,淋巴瘤,增殖,67,慢性B淋巴細胞白血?。˙-CLL）積分系統(tǒng),B-CLL：3-5分；非B-CLL：0-2分,68,ALL/CLL？------MZL,69,CLL,70,CLL,71,MCL,72,HCL,,,,73,HCL,74,FL,75,FL,76,DLBCL,77,

36、DLBCL,78,CLL and Non-Hodgkins Lymphoma,,,,,NK LGL,CD2+CD3+,T-Cell Lineage,CD38+CD2-, CD19-,Plasma CellLeukemia/ Myeloma,B-Cell Lineage,CD19+Clonal Ig,CD16+ and/or CD56+CD2+, CD3-,,,,,CD4+,T-Cell CLLT-Cell Lymphoma

37、T-PLL,ATLL(Adult T-CellLeukemia),T-Cell LGLL,CD8+,,,,,CD7-,Sezary Syndrome,,,,慢淋和T淋巴瘤分類,79,T-CLL與類似淋巴瘤的免疫表型,Antigen T-CLL ATLL T-PLL T-LGL (CD3+) NK-LGL(CD3-)TdT — —

38、 — — —CD1 — — — — —CD2 ++ ++ ++ ++ ++

39、CD3 ++ ++ ++ ++ —CD5 ++ ++ ++ ++ —CD7 +/- +/- ++s

40、 ++ ++CD16 — — — +/- ++CD56 — — — +/- ++CD57 — —

41、 — ++ +CD4+CD8+ — — +/- +/- — CD4-CD8+ — — +/- ++

42、 +/-CD4+CD8- ++ ++ + — —CD25 +/- ++s +/- +/- NRHLADR +/- +/-

43、 — + +,,,,80,81,T-PLL,,,,,,,82,T-PLL,,,,,,,83,,,T細胞克隆（TCR Vβ分析）,84,,,單克隆T細胞,85,86,87,,88,NK- 淋巴瘤,89,NK-淋巴瘤免疫表型,,90,NK-淋巴瘤/白血病,91,γδT-NHL,92,DI=1.7,,LGL,93,94,,BL-DNA,DLBCL-DN

44、A,95,多發(fā)性骨髓瘤（MM）,多發(fā)性骨髓瘤是漿細胞異常增生性疾病。正常漿細胞為CD38+/CD45dim/-，使用 CD38/CD45雙標記檢測外周血和骨髓標本，可以準確劃定漿細胞群。通常使用CD38和CD45，結合輕鏈檢查，對多發(fā)性骨髓瘤細胞進行分析。另外，正常漿細胞的表面標記為CD19+/CD56-，而多發(fā)性骨髓瘤細胞通常為CD19-/CD56+。CD138目前認為是漿細胞最特異的指標。這樣，使用流式細胞儀對外周血或骨髓標本進行多

45、參數分析，并計算異常漿細胞含量，對于多發(fā)性骨髓瘤的診斷和治療評估具有重要意義。,96,MM,97,,,,,,,,,,98,,,,,,,99,100,,,流式免疫分型報告內容,101,流式免疫表型診斷血液腫瘤的劣勢,1、纖維化、硬化的骨髓可能沒有足夠的細胞分析。2、細胞太多聚集或成團也可能沒有足夠的分析細胞。3、硬化的組織也很難得到足夠的分析細胞。4、組織結構關系、形態(tài)關系丟失。5、比例太低的單克隆B細胞很難檢測到。,102,流式