1、熒光生物納米傳感器,彭 洪 尚北京交通大學,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,2010.11.6于蘇州,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,生物傳感器,熒光,納米,生物分子 電解質(zhì)離子 溶解氣體 溫度,,signal,靈敏度高無損傷響應(yīng)速度快二維平面成像,生物材料的大?。?細胞： 100 -10 um 細胞器：10 -1 um,活體線粒體中NADH的多光子成像。Karl Kasischke, et al. , Cornell Univ

2、ersity.,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,測量細胞中Ca2+濃度。Tsien, R.Y. et al. Science 280, 1954–1955 (1998).,無內(nèi)源熒光,有內(nèi)源熒光,生物檢測對象,,直接測定,引入熒光探針,熒光分子易被細胞內(nèi)某種細胞器封存，或與胞內(nèi)成分發(fā)生非特異結(jié)合，造成熒光信號失真穩(wěn)定性差，存在熒光漂白單一的熒光波長,受探針濃度分布、光電子系統(tǒng)的隨機漂移影響為適應(yīng)自由進出細胞膜，分子結(jié)構(gòu)需特殊的功能化,第

3、十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,熒光探針分子,,,,,,,基質(zhì)具有保護作用，防止了熒光分子與細胞內(nèi)成分發(fā)生作用，同時提高了穩(wěn)定性提高了熒光強度（大量熒光分子封裝于一個顆粒中），即高信噪比；同時封裝兩種以上熒光分子，實現(xiàn)比率熒光傳感多種成熟進入細胞方法：基因槍、皮量注射槍、細胞內(nèi)吞作用,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,胞內(nèi)檢測溫度、pH的意義,認識細胞內(nèi)的復(fù)雜的生理過程：細胞分裂、基因表達、新陳代謝等 疾病診斷：病態(tài)細胞溫度高于正常細胞，酸化的p

4、H值與組織缺氧以及等其他疾病態(tài)相關(guān) 腫瘤治療：光熱pH值與腫瘤細胞耐藥性有關(guān)系,Part I. 熒光溫度納米傳感器,Hydrophilic Fluorescent Nanogel Thermometer for Intracellular Thermometry，C. Gota et al.， J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 2766.,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,Temperature-sensitive

5、 PolymerWater-sensitive Fluorophore,納米溫度傳感器的橫截面示意圖。溫度探針分子Eu-DT隨機分布于納米顆粒內(nèi)部（由BTD-PMMA組成） ，納米顆粒表面覆蓋著完整（或間斷的）二氧化硅薄層。,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,Luminescent europium(III) nanoparticles for sensing and imaging of temperature in the physiol

6、ogical range. Peng Hongshang et al., Adv. Mater. 2010, 22: 716.,有機硅氧烷BTD：堿性環(huán)境下，硅氧烷基團迅速水解，以及硅醇縮聚，在納米顆粒表面生成帶負電二氧化硅薄層,聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）：減少溫度探針的摻雜濃度，從而降低濃度猝滅以獲得較強的發(fā)光和較長的熒光壽命。PMMA的折射率(1.49)與二氧化硅(1.46)匹配，這也使得生成的納米顆粒擁有較好的光學透明度。,Eu

7、-DT熒光特性：大的斯托克斯位移(200-300 nm) 針狀發(fā)射峰 5D0發(fā)射具有強的溫度依賴特性 可見光激發(fā),熒光溫度探針分子銪-三（二萘甲酰甲烷)-二(三辛基氧化磷) （Eu-DT）,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,溫度納米傳感器的制備及表征,再沉淀-封裝方法制備納米顆粒示意圖,,,,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,Eu-DT摻雜濃度對納米顆粒熒光強度和壽命的影響,,根據(jù)溫度敏感度的定義?I /(Iref?

8、T), 納米顆粒在生理溫度范圍內(nèi)（25-45 oC）的敏感度為-3.07%/oC。假設(shè)熒光強度測量的精確度為±1%，那么Eu-DT納米傳感器的溫度分辨率可以達到± 0.3 oC。,熒光納米傳感器的溫度依賴特性之熒光強度,25-45oC之間，熒光壽命溫度敏感度為-2.2%/oC。,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,熒光納米傳感器的溫度依賴特性之熒光壽命,,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,基于Eu-DT納米顆粒的生物溫敏薄膜的熒光

9、成像,Eu-DT納米顆粒置入生物相容性薄膜聚乙烯醇中。不同溫度、不同壓力下的熒光壽命偽彩色成像。藍色相應(yīng)于最長壽命（400 μs），紅色對應(yīng)于最短壽命（122 μs）。,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,Ratiometric fluorescent nanoparticles for sensing temperature, Peng Hongshang et al., J. Nanopart. Res. 2010, DOI: 10.10

10、07/s11051-010-0046-8.,,,,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,比率熒光納米傳感器的熒光強度的溫度依賴特性,根據(jù)溫度敏感度的定義，納米顆粒的比率熒光強度在生理溫度范圍內(nèi)（25-45 oC）的敏感度為-4 %/oC,Part II. 比率熒光pH納米水凝膠,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,Honghao Sun，et al., Chem. Mater., 2006, 18 (15), 3381,比率熒光pH

11、納米傳感器研究進展,Preston T. S. et al., J. Am. Chem. Soc., 2006, 128 (41), 13320,Hilderbrand S. A. et al., Bioconjugate Chem., 2008, 19 (8), 1635,納米水凝膠的截面示意圖及組成成分化學結(jié)構(gòu)式。在聚亞胺酯水凝膠中，溴百里酚蘭，香豆素6和尼羅紅隨機分布。,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,Nanogel for Ratio

12、metric Fluorescent Sensing of Physiological pH Values. Hongshang Peng et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49: 4246-4249.,聚亞胺酯（PU）：基質(zhì) 溴百里酚蘭（BTB）：pH指示劑， pKa=7.6 香豆素6（C6)：綠色熒光分子 尼羅紅（NR）：紅色熒光分子,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,比率熒光pH納米水凝膠的制

13、備及表征,再沉淀法：將PU, BTB, C6 和NR按照一定比例溶于乙醇/水（9/1）的混合溶液中，然后于水中透析24小時，經(jīng)200nm的膜過濾，即得到水凝膠分散液,,納米水凝膠在水溶液中的粒徑分布,,比率熒光納米水凝膠的pH傳感機理,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,,比率熒光納米水凝膠的pH響應(yīng)特性,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,比率熒光納米水凝膠的pH校正曲線。實驗數(shù)據(jù)由620nm 和500nm處的熒光強度比計算得到，擬合方程為,450 n

14、m激發(fā)下，熒光納米水凝膠在不同pH值（4.92, 5.29, 5.91, 6.24, 6.47, 6.64, 6.81, 6.98, 7.38, 7.73, 8.04, 8.34, 8.67, and 9.18）下的熒光發(fā)射光譜,BTB的離解平衡式可以表示為： 可相應(yīng)得到BTB 的解離常數(shù)Ka為假定納米水凝膠中熒光分子的熒光強度服從Beer-Lambert定律：納米水凝膠的熒光

15、強度比率NR (620 nm) / C6 (500 nm)可以寫為通過常數(shù)設(shè)定，最后簡化為下式,,,,,,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,納米水凝膠pH熒光響應(yīng)性的理論推導(dǎo),在505 nm和620 nm處的熒光強度變化分別為+8% 和-8%，說明微量熒光分子的泄露。,第十二屆全國發(fā)光學術(shù)會議,比率熒光納米水凝膠的穩(wěn)定性,,C,,,A,,B,負載納米水凝膠的小老鼠正常腎上皮細胞（pH 7.4）的熒光顯微照片：綠色通道（A）、紅色通道（B）