1、p c D N A 3 ．卜p r e S l 一G F P 重組質粒的構建及其在小鼠精子內的表達摘要目的構建含有綠色熒光蛋白( g r e e n f l u o r e s c e n tp r o t e i n ，G F P ) 基因與乙型肝炎病毒( h e p a t i t i sB v i r u s ，H B V ) p r e S l 基因的重組真核表達載體p c D N A 3 ．1 - p r e S l 一G F

2、 P ，觀察并檢測該重組質粒在小鼠精子內的表達。方法采用聚合酶鏈反應( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ，P C R ) 方法，以p B R 3 2 2 ．H B V質粒為模板擴增H B Vp r e S l 基因片段，將P C R 擴增得到的H B V p r e S l 基因片段與含有G F P 的真核表達載體p c D N A 3 ．1 ．G F P 分別進行E c o

3、RI 和X b a I 雙酶切，以T 4連接酶過夜連接，經(jīng)酶切及測序鑒定后，用脂質體L i p o f e c t a m i n e T M 2 0 0 0 轉染小鼠精子，在熒光顯微鏡下觀察G F P 有無表達，并應用P C R 檢測H B V p r 西J 『基因的存在。結果①利用D N A 重組技術將p r e S l 基因插入到p c D N A 3 ．1 一G F P 質粒中，經(jīng)雙酶切及測序鑒定，成功構建了p c D N A

4、3 ．1 一p r e S l 一G F P 真核表達載體；②將重組質粒按一定比例轉染小鼠精子后，在熒光顯微鏡下觀察到轉染精子頭部有較明亮的綠色熒光；③提取轉染精子D N A ，經(jīng)P C R 擴增得到位于H B V p r e S l 基因區(qū)域內長約5 8 9 b p 的片段，與預期一致。結論①以上研究結果證實，重組質粒p c D N A 3 ．1 ．p r e S l ．G F P 已得到成功構建，這為建立新型H B V 垂直傳遞小鼠

5、模型提供了可能；②重組真核表達載體p c D N A 3 ．1 一p r e S l 一G F P 在小鼠精子內的表達，表明重組質粒p c D N A 3 ．1 - p r e S l - G F P 可用于制備轉基因小鼠，同時G ．即還可作為H B V p r e S l 基因存在與否的報告基因。因此本研究為建立新的H B V 垂直傳遞小鼠模型，進而更好地研究H B V 的垂直傳播機制奠定了實驗基礎。碩士研究生：指導教師：李茜( 遺傳

6、學)王培林教授關鍵詞：乙型肝炎病毒；重組質粒；綠色熒光蛋白；小鼠精子；轉染目錄弓l 言?????????????????????????????????????????????．1第l 章材料與方法????????????????????????????31 ．1 研究對象??????????????????????????????·31 ．2 試劑與材料?????????????????????????????”31 ．3

7、器材及其來源????????????????????????????．51 ．4 方法???????????????????????????????????????????6第2 章結果2 ．1 p c D N A 3 ．1 一p r e S l 一G F P 重組載體鑒定???????????????????1 42 ．2 轉染前后精子活力評估結果??????????????????????1 62 ．3 重組質粒轉染精子后綠色熒光的

8、鑒定??????????????????1 62 ．4 轉染后精子D N A 內p r e S l 的檢測與表達????????????????·1 7第3 章討論????一 1 93 ．1H B V 的垂直傳遞??????????????????????????“1 93 ．2p c D N A 3 ．1 一p r e S l ·G F P 重組載體的構建?????????????????·1 93 ．3