1、 I 摘 要 小 GTP 酶是一類單體的 G 蛋白，通過在活性態(tài)和非活性態(tài)之間的轉換，參與細胞信號的調控。 GTP 酶激活蛋白(GTPase–activating proteins,GAPs)和 GTP 酶鳥苷酸交換因子(Guanine-nucleotide exchange factors,GEFs)共同參與調節(jié)這一轉換， 前者促進小GTP 酶水解，后者幫助小 GTP 酶結合 GTP。 hArap3 是具有 ArfGAP 和 Rh

2、oGAP 的雙 GAP 活性的激活蛋白。 hArap3 有 9 個結構域，包含 1 個 SAM、5 個 PH、 1 個 ArfGAP、1 個 RhoGAP 和 ANK 重復結構域。它在細胞扁平偽足的形成， 細胞的遷移， 細胞骨架的重組和細胞質膜的運輸過程中發(fā)揮著重要的作用。 根據(jù)前期的研究成果:邊界為 329-641 氨基酸殘基的 Tev-PH-ArfGAP結構域在大腸桿菌中高效表達， 但無法得到適合核磁三共振實驗的蛋白質樣品。 通過優(yōu)

3、化表達載體獲得 Thrombin-PH-ArfGAP 融合蛋白，其酶切效率相較 于前期Tev-PH-ArfGAP 的 10h 酶切 40%提高到 4h 酶切 100%，且無需二次 Ni-NTA 柱純化。PH-ArfGAP 對于溫度較為敏感，這些改善減少了核磁樣品的純化流程和時間，有利于提高其在收集核磁數(shù)據(jù)時的穩(wěn)定性。 隨后的 1H,15N HSQC 實驗表明重組表達的目的蛋白具有一定的二級結構。通過 PH-ArfGAP 和 Arf6 的

4、核磁滴定實驗結果顯示在PH-ArfGAP 的 1H,15N HSQC 譜圖中，有部分交叉峰消失或移動，二者是否有相互作用還在進一步探索中。運用核磁三共振技術收集了有效的數(shù)據(jù)，PH-ArfGAP 的主鏈化學位移認證工作已經(jīng)完成。 作為 Arf6 的 GEF，hEFA6A 蛋白對 Arf6 有高度的選擇性和親和性。它參與調節(jié)細胞內膜的循環(huán)， 引起肌動蛋白細胞骨架的重組， 調控樹突棘的發(fā)育和鞏固。 hEFA6A全長 1024 個氨基酸，包括

5、1 個 PH，1 個 Sec7，2 個富含脯氨酸區(qū)域和一個無規(guī)則卷曲的區(qū)域， Sec7 結構域起核心的 GEF 催化作用， PH 結構域起定位于質膜的作用。 本研究在大腸桿菌中原核表達 Sec7(497-719)結構域，初次表達純化，發(fā)現(xiàn)目的蛋白降解嚴重。通過分析 Uniprot，Jpred，NCBI，Expript 的比對和預測結果，選擇 7 種不同邊界的殘基：Sec7(481-719)、Sec7(467-719)、Sec7(497-

6、726)、Sec7(467-734)、Sec7(530-719)、Sec7(519-719)、Sec7(506-719)來探索結構域的穩(wěn)定性。經(jīng)過 Ni-NTA柱和 Superdex200 柱純化， SDS-PAGE 電泳檢測結果表明: Sec7(530-719)在室溫下 18d天后無明顯的降解。 隨后的 1H,15N HSQC 實驗表明重組表達的 Sec7(530-719) 具有一定的二級結構且溶液狀態(tài)良好，為其后續(xù)的研究奠定了基礎。