1、· 5 8 ·A n i ma lHu s b a n d r y＆ Ve t e r i n a r yMe d i c i n e2 0 0 9Vo 1 ． 41N o ． 9鴦 一{留 薯。 = 奠銎j=霧 0jl l l。P C V 2 對體外培養(yǎng) 仔豬脾細胞分泌細 胞 因子 的 動 態(tài) 影 響 陳耿 ，趙 焱 ，包 銀莉 ，孟玲玲 ，田忠 園，李桂平 ，華利 忠 ，張書霞( 南京農 業(yè)大學動物醫(yī)學院 ，

2、江蘇 南京 2 1 0 0 9 5 )摘要 ：為進一步了解豬圓環(huán)病毒2 型 ( P C V 2 )引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的機理，選取 5 頭3 5日 齡 P c v 2 血清抗體陰性的斷奶仔豬 ， 無菌 取脾臟制成單個 細胞懸液 ，體外培養(yǎng) ，分 P C V 2感染組 與對照組 。分別在培養(yǎng)后 0h 、 6h 、1 2h 、 2 4h收獲細胞培養(yǎng)上 清，用 豬特異性 E L I S A試 劑盒測定上清中自細胞介素- 1 p ( I

3、 L ． i p ) 、腫瘤壞死因子． O t( T N F - a ) 、白細胞介素 6 ( I L - 6 )和 白細胞介素 1 O ( I L 一 1 0 )的含量。結果顯示 ： 病 毒 組 I L - 1 B和 I L - 6 在不 同時間點的含量變化均不 顯著 ( P > 0 ． 0 5 ) ，I L 一 1 B 在 6h 、 2 4h 略高于對照組 ，1 2h 則低于對 照組 ；1 L 一 6除在 6h高于對 照組 外

4、 。其余時間點均低 于對照組 ；病毒組 T N F — a和 I L — l 0的含量在 6h 、1 2h 、2 4h 均高于對照組 ，且 T N F -在 6h 和 2 4h 極顯著升高 ( P < 0 ． O 1 ) ，而 I L 一 1 O 在 1 2h 顯著高于對照組 ( P < 0 ． 0 5 ) 。上述結 果表明：P C V 2 能影 響體外培養(yǎng) 的仔豬脾 細胞某些細胞 因子的分泌 ，而且可能通過 T N F -

5、 d的 高表達促使機體產生全 身炎癥反應綜合征甚至多系統 衰竭 ，而通過 I L — l O 的高表達促使機體產生免疫抑制 。關鍵詞 ：豬圓環(huán)病毒2型；仔豬； 脾細胞；細胞因子 中圖分類號 ：$ 8 5 2 ． 6文獻標識碼 ： A文章編號 ： 0 5 2 9 - 5 1 3 0 ( 2 0 0 9 ) 0 9 — 0 0 5 8 — 0 3豬 圓環(huán)病毒 2型 ( P o r c i n ec i r c o v i m s ，P C

6、V 2 )是 一 種小的無囊膜單股環(huán)狀 D N A病毒 ，普遍認為它是 斷奶仔 豬多 系統衰 竭綜合 征 ( P o s t w e a n i n gM u l t i s y s -t e m i cWa s t i n gS y n d r o m e ， P MWS ) 的主 要 病 原 。這 種 疾病 1 9 9 1 年在加拿大西部首次發(fā)現之后 ，目前世界 各地都有報道。P M WS 豬主要以進行性消瘦 、全身淋 巴結腫大 、

7、呼吸困難為主要特征 ，有些病例還有皮膚 蒼白、黃疸和腹瀉。其主要的組織病理學變化包括 ：淋巴細胞缺失¨J 、間質性肺炎 、肝 炎等。P C V 2的 抗原和核酸在 P M WS 豬 的很多種不 同類 型的細胞 中都能檢測到，但 以單核／ 巨噬細胞及單核／ 巨噬細胞系的其他細胞最普遍 ，有時在 自然發(fā)病豬的 B 、T淋 巴細胞 中也能檢測到 。自然發(fā)病 的 P M WS豬淋 巴組織 表現 出嚴重的全身性 的淋巴細胞凋亡。有些研究

8、表明 P M WS 豬存在淋 巴細胞 的缺失并 且其血 液 中 C D、C D、I g M等淋巴細胞亞群的 比例發(fā)生變化。目前，對臨床發(fā)生 P M WS 和 P C V 2 亞臨床感染豬各免疫器官 和血清中相關細胞 因子 的研究較多 j ，有些文獻還 對 P M WS豬 外 周 血 單 個 核 細 胞 ( p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s ， P B M

9、 C )對 P C V 2的再 次應答時相 關細胞因子的表達變化進行 了研究。 。，然而 P C V 2對 仔豬脾細胞相關細胞因子分泌的影響如何 ，特別是在 收稿 E t 期 ： 2 0 0 9 — 0 3 — 2 6基金項 目：國家 自然 科學 基金 ( 3 0 4 7 1 3 0 2 ；3 0 8 7 1 8 4 8 ) ；南 京農 業(yè)大學 S R T 計劃 ( 0 7 0 4 A 1 2 ) 。作者簡介 ：陳耿 ( 1 9 8 4

10、 一) ，男 ，碩士研究生。通訊作者。病毒作用后細胞因子的動態(tài)變化尚未見報道。本試驗 主要研究 P C V 2 對體外培養(yǎng)的仔豬脾細胞分泌 I L 一 11 3 、I L 一 6 、I L ． 1 0 、T N F ． o t 等細胞 因子 的動態(tài) 變化 ，探討 P C V 2 引起 P M WS 發(fā)生和仔豬免疫功能變化 的動態(tài)過 程 ，為防治該病提供理論依據。1 材料與方法 l - 1 病 毒 P C V 2 ． 上海株 ( P C

11、V 2 ． S H)由南京農業(yè)大學農業(yè) 部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室提供 ，通過間接免疫 熒光 試驗 及 P C R測 定 ，病 毒滴 度為 5 × 1 0TCI D5 o ／mL。1 - 2 主 要試劑 豬 I L ． 11 3 、I L 一 6 、 I L 一 1 0 特異性酶聯免疫吸附檢測 ( E L I S A )試劑盒購 自 美 國 A D L公司；豬特異性 T N F —o 【 E L I S A 試 劑 盒

12、 購 于 晶美 公 司；蛋 白酶 K 購 自M E R K E公司 ； R P M I 1 6 4 0培養(yǎng)基購 自G i b c o 公司 ；酶 標儀 ( S y n e r g y 2 )為美國 B i o t e k 公 司產品 ；臺式離心 機 ( T G L 一 1 6 C型，上海安亭科學儀器廠 ) ；恒溫水浴 鍋 ( H H 一 6型 ，國華電器有限公司)等。1 ． 3 試 驗設 計 5頭3 5日 齡經 E L I S A法檢測

13、血清 P C V 2 和豬繁殖 與呼吸綜合征病毒 ( P R R S V)抗體 陰性 的普通斷奶 健康仔豬購 自江蘇省盱眙縣 。隔離飼喂 3d 后 ，頸靜 脈放血 致 死 ，無 菌摘 取 脾 臟 ，機 械 法 分 離，用 含 1 0 ％小 牛血清的 R P M I - 1 6 4 0培養(yǎng)液制成單個細胞懸 液 ，調整細胞濃度為 6 x 1 0~ “ ／ m L ，分為對照組和病 · 6 0·An i ma lHu s

14、b a n d r y& Ve t e r i n a r y Me d i c i n e2 0 0 9Vo 1 ． 4 1N o ． 93 討論 I L ． 1B 、I L 一 6作為炎癥反應 的重要介質，具有多 種免疫調節(jié)功能 ，包括參與機體的防御和促進全身反 應性炎癥等 J 。本試驗 中 I L - 1 8和 I L 一 6含量 的變化 趨勢比較一致 。在接種 P C V 2后 6h ，病毒組 中二者 的含量均比對照

15、組高 ，而在 1 2h和 2 4h病毒組 中 I L -6的含量均低于對照組 ，且病毒組 I L 一 1B的含量在 l 2h 低于對照組 ， 2 4h又恢復到正常水平。I L 一 1 1 3 和 I L -6的這種變化情況 與 S i p o s的研究 結果是一致 的 J 。試驗中分離脾細胞的方法并不能將脾臟 中存在的巨噬 細胞分離去除，故在我們分離的脾細胞 中除含有大量 的淋巴細胞外 ，還含有一定量的巨噬細胞。在脾臟免 疫細胞 的組

16、成中，9 0 ％為淋 巴細胞 ( T細胞 3 5 ％ ，B細胞約占5 5 ％) ，另約 1 0 ％為巨噬細胞 。P C V 2的 抗原與核酸主要存在于單核／ 巨噬細胞 內，且上皮 與 內皮細胞很 可能是 病毒 增殖 的主要 場所 。因而 ，病毒在單核／ 巨噬細胞系的細胞和其他抗原提呈細胞 中的寄生與復制 ，可能對這些細胞合成與分泌 I L 一 1B和 I L 一 6 產生較大影響。提示 P C V 2可能通過影 響其 相應宿主細胞的生理

17、代謝 ，改變細胞因子表達進而影 響機體的免疫 應答。細胞培養(yǎng) 上清 中 I L ． 1p和 I L - 6在 P C V 2作用的早期有輕微的升高 ，這可能 為單核／巨噬細胞系的活化提供了某些證據 ，而在 P C V 2作用 的后期 ，I L 一 1 1 3和 I L 一 6又出現下降 ，提示單核／ 巨噬 細胞系的活性在 P C V 2 作用的后期受 到了抑制。這與 機體在針對多種病原體 的免疫 應答 中的特 點是一致 的，即在感染 的

18、早期能激活機體的免疫應答 ，而在感 染的后期能抑制機體的免疫應答¨。接種 P C V 2 后的所有時間點 ，病毒組 T N F - 儀的含 量始終 高 于對 照組 ，這 與 S i p o s的 報道 不 一 致 。T N F 一 儀作為一種主要 由單核／ 巨噬細胞產生 的重要早 期促炎因子和免疫調節(jié) 因子 ，其含量始終處于高水平 表達 ，在增強機體免疫應答 的同時 ，也能造成多種組 織的損傷 ，提示 P C V 2可能通過上

19、調 T N F — O f ． 的表 達 ，進而導致 多種組織的損傷 ，甚至 出現 P M WS的 臨床癥狀 ，即 P C V 2引起 P M WS 很可能與該病毒能引起感染豬持續(xù) 高水平 表達 T N F ． O t 有關。有趣 的是 在 促使機體發(fā)生免疫抑制 中起重要作用 的 I L ． 1 0 ，在接 種 P C V 2 后 的所有時間點 ，其在病毒組中的含量均高 于對照組 ，特別是在攻毒后的 1 2h ，病毒組細胞培養(yǎng) 上清 中

20、 I L — l O的含量要顯著高于對照組。這與很多文 獻報道在 自然發(fā)病 的 P M WS病例免疫器官或組織 中I L — l 0的含量升高是一致 的 ，提示 P C V 2能通過上 調 I L - l 0的表達而使機體產生免疫抑制。本試驗中我們選取 4 種在炎癥發(fā)生發(fā)展 中扮演重 要角色 的細胞因子為研究對象，以期探討 P C V 2的致 病機理 。結果發(fā)現 P C v 2能引起體外培養(yǎng)的仔豬脾細 胞在表達這些細胞因子中發(fā)生有規(guī)律的

21、變化，特別是 對 I L ． 6 、T N F ． O t 、I L ． 1 0的影 響較大。這種 變化提示 病毒可能通過刺激炎癥反應而發(fā)揮作用。這也能夠解 釋為什么在 P C V 2 感染豬中能觀察到典型的肉芽腫性 損傷。這種機制能夠促使 巨噬細胞趨化到感染部位 ，因而也增加 了病毒找到新靶細胞的機會。參考文獻 ：韓惠利 ，張書霞 ， 施旅娟． P C V 2對體外 培養(yǎng)仔 豬淋 巴細胞凋 亡的影響 [ J ] ．南京農業(yè)大學學報 ，

22、 2 0 0 8 ，3 1 ( 1 ) ： 9 2 - 9 5 ．施旅娟 ，韓惠利 ，張書霞 ．P c V 2感染仔 豬淋 巴結 中的病 毒定 位與細胞凋亡 [ J ] ．中國農業(yè)科學 ， 2 0 0 8 ， 4 1 ( 1 ) ：2 3 7 - 2 4 2 ．S i p o sW ，D u v i g n e a uJC，W i l l h e i mMF ，e ta 1． S y s t e m i cc y t o k i n e

23、p r o f i l ei nf e e d e rp i g ss u f f e r in gf r o m n a t u r a lp o s t we a n i n gmu h i s y s t e mi ew a s t i n gs y n d r o me( P MWS)a sd e t e r m i n e db ys e mi q u a n t i t a t i v eR T -P C Ra n df

24、l o wc y t o m e t r i ci n t r a c e l l u l a rc y t o k i n ed e t e c t i o n [ J ] ． V e t —e r i n a r yI mmu n o l o g ya n dI mmu n o p a t h o l o g y ，2 0 0 4，9 9：6 3 - 71 ．Da r wi c hL，Pi eS，Ro v i r aA，e ta 1

25、 ．Cy t o k i n emRNA e x p r e s s i o np r o —f i l e si nl y mp h o i dt i s s u e so fp i g sn a t u r a l l ya f f e c t e db yp o s t we a n i n gm u h i s y s t e m i cw a s t i n gs y n d r o m e[ J ] ．J o u ma l

26、o fG e n e r a lV i r o l o g y，2 0 03，8 4：21 1 7 - 2 1 2 5．D a r w i c hL ，S e g a leSJ ， R e s e n d e sA ， e ta 1 ． T r a n s i e n tc o r r e l a t i o nb e —t we e nv i r e mi al e v e l sa n dI L - 1 0e x p r e s s

27、 i o ni np i g ss u b c l i n i c a ll yi n f e c · -t e dw i t hp o r c i n ec i r c o v i r u st y p e2( P C V 2 ) [ J ] ． R e s e a r c hi nV e t e r -i n a r yS c i e n c e ，2 0 0 8，8 4：1 9 4- 1 9 8 ．D a r w i e

28、 hL ，B a l a s c hM，P l a n a · D u r a nJ ，e ta 1． C y t o k i n ep r o f i l e so fp e r i p h e r a l b l o o dmo n o n u c l e a rc e i l sf r o m p i g swi t hp o s t we a n i n gmu l t i —s y s t e mi cwa s

29、 t i n gs y n d r o mei nr e s p o n s et omi t o g e n，s u p e r a n t i g e no rr e c a l lv i r a la n t i g e n s[ J ] ． J o u r n a lo fG e n e r a lV i r o l o g y， 2 0 0 3 ， 8 4 ：3 4 5 3 - 3 4 5 7．楊 漢 春． 動 物 免 疫 學

30、 [ M] ． 北 京 ：中 國 農 業(yè) 出 版 社 ，2 0 0 3：3．李 大 金． 生 殖 免 疫 學 [ M] _ 上 海 ：復 旦 大 學 出 版 社 ，2 0 0 8：7．Pe r e z ． Ma r tI nE，Ro v i r aA ，Ca l s a mi g l i aM ，e ta 1 ．A n e wme t h o dt oi d e n t i ~c e l lt y p e st h a ts u p

31、p o ~p o r c i n ee i r c o v i r u st y p e2r e p l i c a t i o ni nf o r m a l i n ． f i x e d 。 p a r a f f i n — e m b e d d e ds w i n et i s s u e s[ J ] ．J o u r n a lo fVi r o l o g i c a lMe t h o d s ，2 0 0 7：6