1、克羅諾桿菌（Cronobacter）是一種普遍存在于自然環(huán)境中的條件致病菌，不但存在于被污染的食品和食品工廠中，還幾乎能夠從所有的環(huán)境中分離得到。感染克羅諾桿菌的高危人群是嬰幼兒，死亡率高達20％～50％，幸存下來的嬰幼兒也可能導致嚴重的神經系統(tǒng)后遺癥。因此，建立一種在嬰幼兒奶粉中快速、靈敏、高效、可靠的檢測克羅諾桿菌的方法是至關重要的。
　　實時熒光單引物等溫擴增技術(RF-SPIA)是以單引物等溫擴增技術(SPIA)為理論依據

2、，將熒光染料與SPIA技術相結合，利用恒溫擴增實時熒光檢測系統(tǒng)(DEAOUARTⅡ)，將實時熒光監(jiān)測儀與電腦相連，通過熒光信號的積累，實時監(jiān)測反應進程，可自動判定反應結果的陰性與陽性，并生成反應結果圖。
　　根據克羅諾桿菌在GenBank中16S rRNA基因(HQ880288.1)，利用軟件PrimerPremier5.0、DNAMAN設計RF-SPIA引物及Blocker，對反應體系中各添加物條件進行優(yōu)化，確定25μL的RF-

3、SPIA的反應體系:25 mmol/L MgSO40.8μL，10 mmol/LdNTPs2.0μL，10μmol/L引物2.0μL，2×BcaDNA聚合酶緩沖液2.0μL，5×RNaseH緩沖液1.5μL，40 U/μL核糖核酸抑制劑0.6μL，20 mg/mL Bovine Serum Albumin0.9μL，10μmol/L Blocker1.0μL，20 U/μL BcaDNA聚合酶1.0μL，60 U/μL RNaseH0.

4、6μL，模板1.0μL，SYBR GreenⅡ(1∶400)1.0μL，RNase-free Water補足反應體系。RF-SPIA反應程序:掃描頻率為60 s一次，反應溫度為61℃，反應時間120 min（通過觀察反應情況隨時停止）。
　　本研究以15株克羅諾桿菌和29株非克羅諾桿菌作為試驗菌株進行RF-SPIA試驗的引物特異性驗證，發(fā)現(xiàn)陽性結果均為克羅諾桿菌株，其余非克羅諾桿菌菌株結果均顯示陰性，由此證明試驗所設計的引物特異性

5、高，可用于克羅諾桿菌的檢測。本試驗對克羅諾桿菌純培養(yǎng)的靈敏度達到1.4×100 CFU/mL，對克羅諾桿菌基因組的靈敏度達到7.5×101 fg/mL，將克羅諾桿菌人工污染嬰幼兒配方奶粉，并測定其檢出限達到8.1×102 CFU/g。通過離心沉淀及紫外照射，試驗結果可用肉眼直接觀察。
　　本研究所建立的實時熒光單引物等溫擴增技術檢測嬰幼兒配方奶粉中克羅諾桿菌的方法特異性強、靈明度高，方便快捷，還可肉眼觀察結果。該檢測方法不需要繁瑣