1、學(xué)校代碼：10385分類號(hào)：研究生學(xué)號(hào)：1301415003密級(jí)：齒蘭環(huán)斑病毒抗原表位的鑒定及其齒蘭環(huán)斑病毒抗原表位的鑒定及其在抗體純化中的在抗體純化中的應(yīng)用研究應(yīng)用研究EpitopemapingofOdontoglossumRingspotViruscoatproteinapplicationfpurificationofspecificantibody作者姓名：鄭國(guó)華鄭國(guó)華指導(dǎo)教師：林毅林毅教授教授實(shí)踐導(dǎo)師：明艷林明艷林研究員研究員

2、專業(yè)學(xué)位類別領(lǐng)域：生物工程生物工程研究方向：基因基因工程工程所在學(xué)院：化工學(xué)院化工學(xué)院論文提交日期：二零一七年五月九日摘要III摘要齒蘭環(huán)斑病毒(OdontoglossumringspotvirusSV)屬于煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），是導(dǎo)致蘭花失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值的主要病毒之一。近年來(lái)，由于國(guó)際市場(chǎng)對(duì)SV有較高的檢疫要求，蘭花種苗生產(chǎn)企業(yè)及進(jìn)出口檢疫部門對(duì)該病毒檢測(cè)產(chǎn)品有較大需求。但是，由于SV與同屬病毒存在明顯血清學(xué)

3、交叉反應(yīng)，導(dǎo)致使用多克隆抗體的檢測(cè)產(chǎn)品準(zhǔn)確性較差，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。本文為提高檢測(cè)產(chǎn)品的準(zhǔn)確性，首先使用SV多克隆抗體（SVPAbs）對(duì)噬菌體展示7肽庫(kù)進(jìn)行淘洗富集；采用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定噬菌體展示多肽的基因序列，得到4681條序列，其中有58條推導(dǎo)的氨基酸序列與SV高度同源，主要分布在1~35aa、43~68aa、107~153aa；同時(shí)結(jié)合位點(diǎn)保守性，初步表明SV的特異抗原表位位于：2SYTITDPSKLAYLSSAWADPNSLI

4、NLCTN30、50ADVWQPVPTLTSRFPAGAGYFR71、141MYNQVSFETMSGLTWTSS158。進(jìn)一步利用原核表達(dá)得到15個(gè)C端攜帶SVCP多肽片段的融合蛋白；采用ELISA測(cè)定這些融合蛋白與SVPAbs的親和特異性，發(fā)現(xiàn)攜帶SVCP130aa區(qū)域短肽的融合蛋白（共5個(gè)）以及5675aa區(qū)域的融合蛋白（共4個(gè)）均與SVPAbs存在明顯親和反應(yīng)。因此，本研究明確了SVCP特異性的抗原表位為：2SYTITDPSKLA

5、YLSSAWADPNSLINL27、56VPTLTSRFPAGAGYFR71。最后，本研究通過(guò)化學(xué)合成得到SV1（2SYTITDPSKLAY13）、SV2（15SSAWADPNSLINL27）、SV3（58TLTSRFPAGAGYFR71）3個(gè)多肽，并作為配基分別偶聯(lián)到CNBr活化瓊脂糖凝膠FF制備得到3種親和介質(zhì)；利用這些親和介質(zhì)從SVPAbs中純化得到3個(gè)多肽抗體AntiSV1、AntiSV2、AntiSV3；經(jīng)ELISA測(cè)定表明，