1、ABCG(ATP-binding cassette transporter G)轉運蛋白是ABC家族轉運子的一個成員，是一類跨膜轉運蛋白，通過水解ATP的能量對胞質中的外源化合物、代謝產(chǎn)物、離子、糖、氨基酸、脂類等物質進行跨膜轉運。本文以我國漁用抗生素的使用情況為依據(jù)，以甲殼類重要養(yǎng)殖品種三疣梭子蟹為研究對象，以養(yǎng)殖過程中常用抗生素——氟苯尼考(FLR)為代表，采用ABCG蛋白特異性抑制劑——煙曲霉毒素C(FTC)對比研究了氟苯尼考在三

2、疣梭子蟹重要組織中的分布及消除情況；首次克隆了三疣梭子蟹ABCG蛋白基因，并測定了氟苯尼考的解毒代謝相關酶及相關基因的表達，并且初步研究了FLR對三疣梭子蟹免疫和抗氧化系統(tǒng)的影響。得到如下結果：
　　1.ABCG蛋白對氟苯尼考轉運活力的測定
　　為檢測三疣梭子蟹ABCG轉運蛋白對氟苯尼考轉運活力的大小，本實驗通過注射ABCG轉運蛋白特異性抑制劑——FTC，比較有無抑制劑對三疣梭子蟹組織中氟苯尼考累積及消除的變化。結果表明，在

3、40mg/kg氟苯尼考劑量下，藥物在體內的累積階段，注射抑制劑FTC組的氟苯尼考在肝胰腺、肌肉、鰓和血淋巴中的累積量均高于無抑制劑組，達峰時間晚。藥物消除階段，抑制劑組消除速度比無抑制劑組緩慢一些，在血淋巴、肝胰腺、肌肉和鰓中的藥物消除半衰期(t1/2)分別是0.85、1.25、1.91、1.35h，而無抑制劑組對應的消除半衰期為0.80、1.00、1.72、1.73h，由此表明三疣梭子蟹ABCG轉運蛋白促進了氟苯尼考的轉運代謝。從各組

4、織ABCG轉運蛋白的活力來看，血淋巴、肝胰腺、肌肉和鰓組織分別在3、3、3、6h達到最大值，然后逐漸降低。轉運活力的大小與各組織中氟苯尼考的累積量相對應，進一步證明了三疣梭子蟹ABCG轉運蛋白對氟苯尼考的轉運作用。
　　2.氟苯尼考對三疣梭子蟹不同組織中ptABCG基因表達量的影響
　　為深入研究ABCG轉運蛋白在氟苯尼考代謝過程中的作用，采用RACE技術克隆獲得三疣梭子蟹ABCG的全長cDNA序列，命名為ptABCG(Ge

5、nBank登錄號：KY242401)。該基因全長2473bp，包括1747bp的開放閱讀框(ORF)，25bp的5’非編碼區(qū)(5’UTR)和701bp的3’非編碼區(qū)(3’UTR)。結構功能域分析顯示，該蛋白具有半轉運子ABCG轉運蛋白的基本結構特征，含有1個疏水性的跨膜區(qū)(transmembrane domain,TMD)和1個核苷酸結合區(qū)(nucleotide binding domain,NBD)；存在由內向外和由外向內的2種跨膜螺

6、旋，因此可判斷獲得的cDNA序列是三疣梭子蟹ABCG轉運蛋白基因序列。采用RT-PCR法，從mRNA水平分析氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、鰓中ptABCG表達的影響。結果顯示，40mg/kg劑量下，3h前FTC+FLR組各組織中ptABCG的相對表達水平受到抑制，顯著低于FLR組(P＜0.05)，隨著抑制劑作用的減弱表達水平迅速提高，肝胰腺、肌肉、鰓中的表達量分別于12、6、12h達到峰值，且高于FLR組，最終兩組的表達都趨于對照水

7、平。此實驗結果從基因水平表明了三疣梭子蟹ABCG轉運蛋白在氟苯尼考的轉運代謝中發(fā)揮著一定的作用。
　　3.氟苯尼考對三疣梭子蟹解毒代謝途徑的影響研究
　　為研究氟苯尼考在三疣梭子蟹體內的解毒代謝途徑，測定了I相解毒代謝酶(APND)、II相解毒代謝酶(GST)的活性及對應基因CYP2、GST和Ⅲ相代謝ABCG基因的相對表達。結果表明，氟苯尼考對三疣梭子蟹各相酶活力及基因表達的影響顯著(P＜0.05)，且呈時間-劑量效應，對照

8、組則無明顯變化。氟苯尼考對肝胰腺、血淋巴APND及CYP2 mRNA表達具有抑制作用，于6h達最低值，隨后逐漸恢復至對照組水平；對肝胰腺GST活性及GST mRNA表達呈誘導作用，且呈現(xiàn)高劑量組>中劑量組>低劑量組。對血細胞中GST mRNA表達的影響與藥物濃度有關，低、中劑量組誘導GST mRNA表達，而高劑量組的表達活受到抑制，于6h時顯著低于對照組(P＜0.05)。不同濃度氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、鰓、肌肉ABCG mRNA的表

9、達均具有誘導作用，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并有一定的時間劑量效應。由此推斷，ABCG蛋白的轉運作用隨著藥物及代謝產(chǎn)物在體內的累積而增強，并且及時將其排出體外，以防對生物體造成損傷。
　　4.氟苯尼考對三疣梭子蟹生理健康指標的影響
　　為研究氟苯尼考對三疣梭子蟹生理健康的影響，對免疫效應和抗氧化防御兩個方面的主要指標進行檢測，結果表明：與對照組相比，氟苯尼考對三疣梭子蟹免疫系統(tǒng)中的抗菌和酚氧化酶活力具有顯著的抑制作用(P＜0.

10、05)，且各劑量組出現(xiàn)一定的時間和劑量效應；對溶菌活力的變化則無顯著影響(P＞0.05)。氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、血淋巴中的總抗氧化能力(T-AOC)、SOD活力、GSH活性均產(chǎn)生顯著影響(P＜0.05)，肝胰腺中T-AOC、SOD、GSH分別于6、6、12h達到最低值，血淋巴中于3、3、6h達到最低值，之后隨時間延長，低(20mg/kg)、中(40mg/kg)劑量組各抗氧化指標逐漸恢復至對照組水平，而高(80mg/kg)劑量組的活