1、ABCG(ATP-binding cassette transporter G)轉運蛋白是ABC家族轉運子的一個成員，是一類跨膜轉運蛋白，通過水解ATP的能量對胞質中的外源化合物、代謝產物、離子、糖、氨基酸、脂類等物質進行跨膜轉運。本文以我國漁用抗生素的使用情況為依據，以甲殼類重要養(yǎng)殖品種三疣梭子蟹為研究對象，以養(yǎng)殖過程中常用抗生素——氟苯尼考(FLR)為代表，采用ABCG蛋白特異性抑制劑——煙曲霉毒素C(FTC)對比研究了氟苯尼考在三

2、疣梭子蟹重要組織中的分布及消除情況；首次克隆了三疣梭子蟹ABCG蛋白基因，并測定了氟苯尼考的解毒代謝相關酶及相關基因的表達，并且初步研究了FLR對三疣梭子蟹免疫和抗氧化系統的影響。得到如下結果：
　　1.ABCG蛋白對氟苯尼考轉運活力的測定
　　為檢測三疣梭子蟹ABCG轉運蛋白對氟苯尼考轉運活力的大小，本實驗通過注射ABCG轉運蛋白特異性抑制劑——FTC，比較有無抑制劑對三疣梭子蟹組織中氟苯尼考累積及消除的變化。結果表明，在

3、40mg/kg氟苯尼考劑量下，藥物在體內的累積階段，注射抑制劑FTC組的氟苯尼考在肝胰腺、肌肉、鰓和血淋巴中的累積量均高于無抑制劑組，達峰時間晚。藥物消除階段，抑制劑組消除速度比無抑制劑組緩慢一些，在血淋巴、肝胰腺、肌肉和鰓中的藥物消除半衰期(t1/2)分別是0.85、1.25、1.91、1.35h，而無抑制劑組對應的消除半衰期為0.80、1.00、1.72、1.73h，由此表明三疣梭子蟹ABCG轉運蛋白促進了氟苯尼考的轉運代謝。從各組

4、織ABCG轉運蛋白的活力來看，血淋巴、肝胰腺、肌肉和鰓組織分別在3、3、3、6h達到最大值，然后逐漸降低。轉運活力的大小與各組織中氟苯尼考的累積量相對應，進一步證明了三疣梭子蟹ABCG轉運蛋白對氟苯尼考的轉運作用。
　　2.氟苯尼考對三疣梭子蟹不同組織中ptABCG基因表達量的影響
　　為深入研究ABCG轉運蛋白在氟苯尼考代謝過程中的作用，采用RACE技術克隆獲得三疣梭子蟹ABCG的全長cDNA序列，命名為ptABCG(Ge

5、nBank登錄號：KY242401)。該基因全長2473bp，包括1747bp的開放閱讀框(ORF)，25bp的5’非編碼區(qū)(5’UTR)和701bp的3’非編碼區(qū)(3’UTR)。結構功能域分析顯示，該蛋白具有半轉運子ABCG轉運蛋白的基本結構特征，含有1個疏水性的跨膜區(qū)(transmembrane domain,TMD)和1個核苷酸結合區(qū)(nucleotide binding domain,NBD)；存在由內向外和由外向內的2種跨膜螺

6、旋，因此可判斷獲得的cDNA序列是三疣梭子蟹ABCG轉運蛋白基因序列。采用RT-PCR法，從mRNA水平分析氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、鰓中ptABCG表達的影響。結果顯示，40mg/kg劑量下，3h前FTC+FLR組各組織中ptABCG的相對表達水平受到抑制，顯著低于FLR組(P＜0.05)，隨著抑制劑作用的減弱表達水平迅速提高，肝胰腺、肌肉、鰓中的表達量分別于12、6、12h達到峰值，且高于FLR組，最終兩組的表達都趨于對照水

7、平。此實驗結果從基因水平表明了三疣梭子蟹ABCG轉運蛋白在氟苯尼考的轉運代謝中發(fā)揮著一定的作用。
　　3.氟苯尼考對三疣梭子蟹解毒代謝途徑的影響研究
　　為研究氟苯尼考在三疣梭子蟹體內的解毒代謝途徑，測定了I相解毒代謝酶(APND)、II相解毒代謝酶(GST)的活性及對應基因CYP2、GST和Ⅲ相代謝ABCG基因的相對表達。結果表明，氟苯尼考對三疣梭子蟹各相酶活力及基因表達的影響顯著(P＜0.05)，且呈時間-劑量效應，對照

8、組則無明顯變化。氟苯尼考對肝胰腺、血淋巴APND及CYP2 mRNA表達具有抑制作用，于6h達最低值，隨后逐漸恢復至對照組水平；對肝胰腺GST活性及GST mRNA表達呈誘導作用，且呈現高劑量組>中劑量組>低劑量組。對血細胞中GST mRNA表達的影響與藥物濃度有關，低、中劑量組誘導GST mRNA表達，而高劑量組的表達活受到抑制，于6h時顯著低于對照組(P＜0.05)。不同濃度氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、鰓、肌肉ABCG mRNA的表

9、達均具有誘導作用，呈現先升高后降低的趨勢，并有一定的時間劑量效應。由此推斷，ABCG蛋白的轉運作用隨著藥物及代謝產物在體內的累積而增強，并且及時將其排出體外，以防對生物體造成損傷。
　　4.氟苯尼考對三疣梭子蟹生理健康指標的影響
　　為研究氟苯尼考對三疣梭子蟹生理健康的影響，對免疫效應和抗氧化防御兩個方面的主要指標進行檢測，結果表明：與對照組相比，氟苯尼考對三疣梭子蟹免疫系統中的抗菌和酚氧化酶活力具有顯著的抑制作用(P＜0.

10、05)，且各劑量組出現一定的時間和劑量效應；對溶菌活力的變化則無顯著影響(P＞0.05)。氟苯尼考對三疣梭子蟹肝胰腺、血淋巴中的總抗氧化能力(T-AOC)、SOD活力、GSH活性均產生顯著影響(P＜0.05)，肝胰腺中T-AOC、SOD、GSH分別于6、6、12h達到最低值，血淋巴中于3、3、6h達到最低值，之后隨時間延長，低(20mg/kg)、中(40mg/kg)劑量組各抗氧化指標逐漸恢復至對照組水平，而高(80mg/kg)劑量組的活