1、石油資源的枯竭與能源需求量增加之間的矛盾日益突出,可再生能源的開發(fā)及利用迫在眉睫。近些年來(lái),雖然在此領(lǐng)域已經(jīng)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步,但原料問題仍舊是制約可再生能源發(fā)展的“瓶頸”。第一代和第二代生物燃料因無(wú)法克服與人爭(zhēng)糧或者與糧爭(zhēng)地的缺點(diǎn),發(fā)展?jié)摿κ艿搅撕艽蟮南拗啤?br>　　目前,作為第三代生物燃料的微藻被世界各地的研究者們所青睞。首先,微藻可以生長(zhǎng)在海洋、河流以及湖泊里,不用占用耕地。其次,相較于陸地植物,微藻具有更高的光合作用效率,更強(qiáng)的富

2、集油脂能力。第三,生長(zhǎng)周期短,可以大規(guī)模培養(yǎng)。因此,微藻被認(rèn)為是制備生物柴油的優(yōu)良材料。此外,微藻尚可合成多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)等高附加值產(chǎn)物,可以有效分?jǐn)偵锊裼偷闹苽涑杀尽?br>　　微擬球藻大洋種(Nannochloropsis oceanica),屬于真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae),微擬球藻屬(Nannochloropsis)。它富含油脂,且富含高附加

3、值產(chǎn)物—EPA,被認(rèn)為是最具開發(fā)潛力的能源微藻之一。即使如此,以微擬球藻為原料生產(chǎn)生物柴油仍舊面臨著成本高的問題。近年來(lái),對(duì)微擬球藻進(jìn)行基因工程改造以獲得品質(zhì)優(yōu)良的工程藻種是降低生物柴油生產(chǎn)成本的重要方向。
　　基于以上思考,本實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線設(shè)計(jì)如下:首先,基于本實(shí)驗(yàn)室之前得到的Nannochloropsis oceanica LAMB0001全基因組測(cè)序結(jié)果,對(duì)多不飽和脂肪酸合成路徑及TAG合成路徑所涉關(guān)鍵酶基因進(jìn)行初步的信息學(xué)分

4、析后;然后,嘗試通過基因工程的手段從以下個(gè)角度對(duì)微擬球藻進(jìn)行基因改造:1,通過同源重組的手段敲除與TAG合成路徑存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的β-氧化路徑上的一個(gè)關(guān)鍵酶基因;2,過表達(dá)PUFA路徑和TAG合成路徑所涉的關(guān)鍵酶基因。期望通過以上工作構(gòu)建出高油脂或高PUFA含量的微擬球藻藻株。
　　我們從N. oceanica全基因組測(cè)序結(jié)果中搜索了PUFA合成路徑中的4種去飽和酶,共6條;負(fù)責(zé)活化脂肪酸的酯酰輔酶A合成酶(ACS),共12條;TAG

5、合成路徑中的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)、蘋果酸酶(ME)、乙酰輔酶A合成酶,各10條、2條、2條。
　　通過對(duì)篩選到的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行初步生物信息學(xué)分析:
　　1,選取參與β-氧化的ACS6基因(負(fù)責(zé)合成脂酰輔酶A合成酶,為β-氧化提供底物)作為同源重組的目標(biāo)基因,進(jìn)行同源重組體系的初步探索。首先,通過PCR擴(kuò)增得到ble基因的表達(dá)框和2個(gè)同源臂,通過一系列的酶切連接,最終將三個(gè)片段連接在一起,構(gòu)成“融合片段”(同源臂1-

6、ble-同源臂2)。然后,通過電穿孔的方法將“融合片段”轉(zhuǎn)化入微擬球藻(N. oceanica),在含有博來(lái)霉素(Zeocin)的f/2固體培養(yǎng)基中進(jìn)行陽(yáng)性克隆的初步篩選。挑取100個(gè)單克隆藻落至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),分別提取其基因組DNA,對(duì)ble基因的ORF進(jìn)行PCR擴(kuò)增。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),野生型微擬球藻中不含ble基因,而98％的轉(zhuǎn)基因藻株中都含有ble基因。但是,從ACS6基因的兩個(gè)同源臂兩側(cè)分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因藻株與野生型藻

7、株條帶一致。換言之,外源DNA雖然已經(jīng)整合到微擬球藻基因組中,但是并不是在目標(biāo)位點(diǎn)上發(fā)生的同源重組。在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步選取24號(hào)轉(zhuǎn)基因藻株,采用LA PCR的方法,對(duì)其基因組上的隨機(jī)整合位點(diǎn)進(jìn)行分析。通過一系列PCR、測(cè)序及數(shù)據(jù)的比對(duì)分析,最終確定在24號(hào)轉(zhuǎn)基因藻株中至少含有兩處隨機(jī)整合的位點(diǎn),分別整合在 N. oceanica的Scaffold8_2(GenBank: AEUM01005401.1)和 Scaffold123_11

8、(AEUM01000672.1)上。通過本部分實(shí)驗(yàn),首先,可以充分證明外源基因整合到了微擬球藻的基因組DNA上;其次,可以看出盡管N. oceanica LAMB0001同源重組的效率極低,但隨機(jī)整合的效率相當(dāng)高,在后續(xù)的研究中可以充分利用如此高效的隨機(jī)整合來(lái)實(shí)現(xiàn)外源基因在微擬球藻中的過表達(dá)。
　　2,選取PUFA合成路徑中微擬球藻的Δ6去飽和酶基因(NoD6)、Δ12去飽和酶基因(NoD12),亦選取了三角褐指藻的Δ5去飽和酶基

9、因(PtD5)和Δ6去飽和酶基因(PtD6)作為過表達(dá)的目的基因;期望能夠通過以上基因的過表達(dá),提高微擬球藻的PUFA含量。選取3條來(lái)自三角褐指藻、1條來(lái)自擬南芥的DGAT基因(負(fù)責(zé)催化 TAG合成最后一步縮合反應(yīng)的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶),分別命名為PtDGAT1、PtDGAT2、PtDGAT3、AtDGAT及前期工作中已經(jīng)克隆并且證實(shí)其產(chǎn)物參與TAG合成的NOLACS基因作為過表達(dá)的目的基因,期望通過對(duì)以上基因的過表達(dá),提高微擬球藻的油

10、脂含量。
　　首先,克隆得到以上9條待轉(zhuǎn)基因的全長(zhǎng)cDNA,然后通過逐步酶切連接的方法將其構(gòu)建到表達(dá)載體 pCB801-MCS骨架上。通過電穿孔的方法,轉(zhuǎn)化微擬球藻。挑取120個(gè)藻落,提取基因組DNA,通過PCR的方法篩選到了12株陽(yáng)性克隆。這12株藻分別來(lái)自5個(gè)基因的實(shí)驗(yàn)組,分別為NoD12、NoD6、PtDGAT1、PtDGAT2和AtDGAT實(shí)驗(yàn)組。對(duì)轉(zhuǎn)基因藻株進(jìn)行進(jìn)一步研究,分別測(cè)定它們的生長(zhǎng)曲線、比生長(zhǎng)速率,并且通過實(shí)時(shí)