1、從編碼遺傳信息的DNA轉(zhuǎn)錄到最終蛋白質(zhì)的合成，這一連串的基因表達(dá)過(guò)程，代表了有機(jī)體內(nèi)最具影響力的生物化學(xué)過(guò)程。很自然地，有機(jī)體進(jìn)化出各種調(diào)節(jié)機(jī)制，在諸多層次確?；虮磉_(dá)的準(zhǔn)確性，一種稱(chēng)為“無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)”途徑或“mRNA檢查(mRNAsurvveillance)”機(jī)制就是其中的一個(gè)非常重要的過(guò)程。
　　NMD（無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解）途徑是一種通過(guò)降解突變

2、的mRNA從而確保基因表達(dá)保真性的mRNA監(jiān)督機(jī)制。顧名思義，NMD途徑負(fù)責(zé)識(shí)別包含有早發(fā)性終止密碼子(PTCs)的mRNA，并將其降解。用“NMD”或“mRNA監(jiān)視”統(tǒng)稱(chēng)這種含有PTC的mRNA代謝途徑，強(qiáng)調(diào)的是一種mRNA的質(zhì)量控制機(jī)制，避免在細(xì)胞中從PTC-mRNA中翻譯出C端截短的蛋白質(zhì)，這很可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生有害的作用。因此NMD途徑在人類(lèi)的一系列疾病中起到很重要的保護(hù)作用，這些疾病多由移碼或無(wú)義突變而產(chǎn)生含有早發(fā)性終止密碼子的m

3、RNA，如:β-地中海貧血癥、囊性纖維病變、肌肉營(yíng)養(yǎng)失調(diào)和癌癥。
　　在NMD途經(jīng)中，結(jié)合在外顯子拼接復(fù)合體上的多種蛋白決定其對(duì)異常轉(zhuǎn)錄物的識(shí)別和降解的啟動(dòng)，其中UPF1和SMG1發(fā)揮主要功能。UPF1是一個(gè)RNA解旋酶和RNA依賴(lài)的ATP酶;而SMG1具有磷脂酰肌醇激酶活性，負(fù)責(zé)UPF1的磷酸化。RNA干擾是哺乳動(dòng)物中功能缺失研究的一種有效基因手段，并且可以作為潛在的治療各種人類(lèi)疾病的方法。這是由于RNA干擾能夠特定的降解靶標(biāo)R

4、NA。另外，通過(guò)病毒載體構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)體系可以有效的應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，使靶標(biāo)基因長(zhǎng)期沉默。
　　本研究構(gòu)建了含有UPF1和SMG-1基因發(fā)夾結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)開(kāi)關(guān)基因表達(dá)干擾質(zhì)粒。我們通過(guò)公認(rèn)的運(yùn)算法則設(shè)計(jì)了19bp siRNAs作為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的靶位點(diǎn)，并且用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)檢查了目標(biāo)位點(diǎn)的唯一性。然后分別合成Smg1，Upf2和control的寡核苷酸鏈。
　　大部分

5、shRNA的表達(dá)都依賴(lài)于RNA聚合酶Ⅲ(pol-Ⅲ)啟動(dòng)子，例如:H1或者U6啟動(dòng)子。我們構(gòu)建的慢病毒載體包含了一個(gè)U6tetO-shRNA元件和一個(gè)CMV驅(qū)動(dòng)的TetR-IRES-GFP盒子。我們將合成的寡核苷酸鏈處理成雙鏈形式通過(guò)限制性酶切位點(diǎn)克隆到pFRT-U6tetO的載體。最后我們將U6tetO-shC，U6tetO-shS和U6tetO-shU插入到pTIG構(gòu)建成完整的可誘導(dǎo)RNA干擾的慢病毒表達(dá)載體:pTIG-U6tetO

6、-shC、pTIG-U6tetO-shS和pTIG-U6tetO-shU。這個(gè)可調(diào)控的RNA干擾體系包括了TetO和TetR。在缺失四環(huán)素或者四環(huán)素衍生物（強(qiáng)力霉素）的情況下，TetR與TetO緊密結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過(guò)程被抑制。而加入四環(huán)素或四環(huán)素衍生物（強(qiáng)力霉素）時(shí)，它們會(huì)與TetR以1∶1的比例結(jié)合，導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生改變，釋放TetO，從而使shRNA正常轉(zhuǎn)錄。
　　我們利用慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293T細(xì)胞得到重組病毒，經(jīng)鑒