簡介：誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細(xì)胞的研究,里程碑式的科學(xué)突破,細(xì)胞重編程的研究概況,核移植,核移植試驗(yàn)最初是在兩棲動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)的，通過將體細(xì)胞核注入到去核卵母細(xì)胞中。迄今，人們已經(jīng)獲得了多種核移植動(dòng)物，也建立了來源于核移植胚胎的胚胎干細(xì)胞系。,體細(xì)胞核移植試驗(yàn)也具有很大的局限性,克隆的效率極低產(chǎn)生的許多后代在各個(gè)階段都體現(xiàn)出嚴(yán)重的發(fā)育異常由于需要卵母細(xì)胞，核移植實(shí)驗(yàn)在人類中的應(yīng)用受到強(qiáng)烈的倫理學(xué)質(zhì)疑這些不足，都制約了核移植技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。,將成熟的體細(xì)胞與多潛能的細(xì)胞（ES細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞等）融合，或者用胚胎干細(xì)胞提取物來處理體細(xì)胞，也可以在一定程度上使體細(xì)胞發(fā)生重編程。,利用這兩種方法，可以實(shí)現(xiàn)某些多功能性標(biāo)志分子的重新表達(dá)和多種分化潛能的獲得。但是，體細(xì)胞與多能性細(xì)胞的融合率較低，融合之后的細(xì)胞具有兩套染色體，并且在移植后會(huì)發(fā)生排斥現(xiàn)象，這就制約了細(xì)胞融合的臨床應(yīng)用。,有沒有相對簡單，又可擺脫材料來源和倫理學(xué)諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢,里程碑式的科學(xué)突破,2006年11月20日，日本京都大學(xué)的山中伸彌（SHINYAYAMANAKA和美國威斯康星大學(xué)的詹姆斯湯姆森（JAMESTHOMSON）分別在細(xì)胞和科學(xué)雜志上發(fā)表重量級論文，宣布他們用基因改造的手段，將人類體細(xì)胞改造成了類胚胎干細(xì)胞，在功能上幾乎可以和胚胎干細(xì)胞相媲美。,詹姆斯湯姆森小組的論文發(fā)表在11月20日的科學(xué)雜志上,俞君英是11月20日科學(xué)雜志論文的第一作者,2006年8月，日本科學(xué)家山中伸彌小組首先在小鼠身上取得成功,誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能性干細(xì)胞,2006年，TAKAHASHI和YAMNAKA將幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入已分化的小鼠皮膚成纖維細(xì)胞，進(jìn)而獲得了類似于胚胎干細(xì)胞的多能性干細(xì)胞，稱之為“誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能性干細(xì)胞”（INDUCEDPLURIPOTENTSTEMCELLS,IPS細(xì)胞）。這一研究明確地證實(shí)了分化的細(xì)胞可以通過少數(shù)幾個(gè)因子的外源導(dǎo)入而被重編程到具有多能性的狀態(tài)，因而受到了整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。,在研究誘導(dǎo)多功能性干細(xì)胞產(chǎn)生的原理機(jī)制之前，先了解一下體細(xì)胞重編程逆轉(zhuǎn)為干細(xì)胞的研究進(jìn)展,體細(xì)胞重編程的過程體細(xì)胞重編程的原理體細(xì)胞不經(jīng)過胚胎逆轉(zhuǎn)為多能干細(xì)胞的方法,成體細(xì)胞核的重編程,1核重編程核移植后供體核停止本身的基因表達(dá)程序，恢復(fù)為胚胎發(fā)育所必需的胚胎化基因表達(dá)程序狀態(tài)。此過程包括染色體結(jié)構(gòu)重建、DNA甲基化、組蛋白乙?；⒂∮浕虮磉_(dá)、端粒長度恢復(fù)、X染色體失活等。,,11DNA甲基化12合子型基因的重新激活，如OCT42重塑核結(jié)構(gòu)主要有包括核纖層A、B、C三種核纖層蛋白的重塑,,,3細(xì)胞質(zhì)重編程MIRNA,MIRNA是決定細(xì)胞分化方向的因子。細(xì)胞中MIRNA成分的改變能提高細(xì)胞對調(diào)節(jié)基因表達(dá)重編程。,,接下來，介紹一下體細(xì)胞重編程不經(jīng)過胚胎逆轉(zhuǎn)為多能干細(xì)胞的方法之一通過特定基因的表達(dá)將體細(xì)胞重編程過程逆轉(zhuǎn)為干細(xì)胞?！盎蛑匦戮幣偶夹g(shù)”，借助“逆轉(zhuǎn)錄酶病毒”為載體,即向皮膚細(xì)胞中植入一組4個(gè)基因OCT4,SOX2,CMYC和KLF4，通過基因重新編排，使皮膚細(xì)胞具備胚胎干細(xì)胞的功能。這種被改造過的細(xì)胞稱作“IPS細(xì)胞”。,,下面簡單介紹一下這些研究中所用到的多能性相關(guān)因子OCT4,SOX2,CMYC和KLF4在多能性調(diào)控中的作用。,1OCT3/4,OCT4（也稱OCT3）屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一員13。是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子。是全能性的標(biāo)志，它能夠促使ICM形成、維持胚胎干細(xì)胞未分化前狀態(tài)并促進(jìn)其增殖。,2SOX2基因,SOX2基因是編碼轉(zhuǎn)錄因子的主控基因（MASTERGENES）家族的一個(gè)成員。轉(zhuǎn)錄因子是些與DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)的蛋白質(zhì),3癌癥基因CMYC,癌癥基因CMYC，是一種最容易過渡表現(xiàn)于人類的致癌基因，它對某些成體干細(xì)胞的自我更新起一定的作用，并可以抑制ES細(xì)胞的分化。,4KLF4,KRUEPPELLIKEFACTOR4，KLF4上皮鋅指轉(zhuǎn)錄因子KLF4舊稱GKLF調(diào)節(jié)體外細(xì)胞的增生與分化,IPS細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)制,,已分化的細(xì)胞,,導(dǎo)入病毒基因OCT3/4、SOX2、CMYC和KLF4,病毒逆轉(zhuǎn)錄,,胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)條件和篩選,IPS細(xì)胞,誘導(dǎo)多功能細(xì)胞,,,,,我們已經(jīng)了解了體細(xì)胞重編程的原理和誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制，下面讓我們再深入了解一下IPS細(xì)胞的研究概況和IPS細(xì)胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)。,IPS細(xì)胞的研究概況（研究方法）,這是一種具有很強(qiáng)創(chuàng)新性的研究方法通過外源導(dǎo)入與多功能相關(guān)并且能使重組細(xì)胞恢復(fù)全能性的轉(zhuǎn)錄基因來誘導(dǎo)體細(xì)胞核發(fā)生重新編程，從而使體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成多能性干細(xì)胞。,這種方法所受的啟示來源于“ES細(xì)胞體細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)”。細(xì)胞的多能性收到許多因子精密而又復(fù)雜的調(diào)控。ES細(xì)胞和體細(xì)胞融合后能誘導(dǎo)體細(xì)胞核的重新編程，ES細(xì)胞中存在著一些因子，這些因子對于多能性的建立可能至關(guān)重要。,,,IPS細(xì)胞的研究概況（兩個(gè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)）,IPS細(xì)胞首先由科學(xué)家TAKAHASHI和YAMANAKA在2006年建立的。實(shí)驗(yàn)原理如下利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在小鼠成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入了4個(gè)與多功能性有關(guān)的基因OCT4,SOX2,CMYC和KLF4。利用多能性標(biāo)志分子FBX15的表達(dá)對轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行了篩選，最終的到了IPS細(xì)胞，這種細(xì)胞的功能和性能幾乎和胚胎干細(xì)胞一樣。,另一個(gè)實(shí)驗(yàn)的對象是人類皮膚成纖維細(xì)胞的重編程，而實(shí)驗(yàn)的過程和上一個(gè)實(shí)驗(yàn)基本相同；。只是對所篩選的轉(zhuǎn)錄基因做了一下修飾去掉了腫瘤相關(guān)因子CMYC，使IPS細(xì)胞的生產(chǎn)更加安全,IPS細(xì)胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)（幾種因子的發(fā)現(xiàn)過程）,日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)ES細(xì)胞中那個(gè)存在著一些因子，這些因子對于多能性的建立可能至關(guān)重要?？茖W(xué)家對24個(gè)與多能性維持相關(guān)的候選基因?qū)胄∈蟪衫w維細(xì)胞中，依次去掉其中一個(gè)基因，最后在得到的10個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)至關(guān)重要的基因，其中任何一個(gè)缺失都將導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗，這4個(gè)基因中的任意2個(gè)或3個(gè)組合都無法形成具有ES細(xì)胞特性的IPS細(xì)胞。從而確定了OCT4,SOX2,CMYC和KLF4這4種基因,人類ES細(xì)胞能夠通過細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)室體細(xì)胞發(fā)生重編程。美國科學(xué)家比較了人類ES細(xì)胞和髓前體細(xì)胞的基因表達(dá)譜，挑選出許多在ES細(xì)胞和髓前體細(xì)胞的基因表達(dá)譜，挑選出許多在ES細(xì)胞中相對高表達(dá)的基因。再根據(jù)這些基因在多能性調(diào)控中的已知功能對其進(jìn)行了排序，從中選出14個(gè)候選基因。將這些基因以不同的組合方式導(dǎo)入一種由人類ES細(xì)胞分化得到的間充質(zhì)樣細(xì)胞后，檢驗(yàn)了不同基因的導(dǎo)入對這種細(xì)胞重編程的作用。最后鎖定了4種因子OCT4,SOX2,NANOG,LIN28,IPS細(xì)胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)（IPS細(xì)胞的篩選）,IPS細(xì)胞的篩選主要有三種方法形態(tài)學(xué)篩選、藥物篩選和選用對多能性更為關(guān)鍵的基因作為報(bào)告基因。其中利用FBX15對IPS細(xì)胞進(jìn)行篩選，原理是FBX25對于多能性的維持和胚胎的發(fā)育來說是不可缺少的基因，所以FBX25作為篩選IPS細(xì)胞的報(bào)告基因。僅利用形態(tài)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)來代替報(bào)告基因的篩選。MAHERALI等人發(fā)現(xiàn)，僅僅依靠形態(tài)學(xué)篩選可能就足以建立IPS細(xì)胞系。后來的研究證實(shí)了在不對供體細(xì)胞做任何額外遺傳修飾的情況下，僅依靠形態(tài)學(xué)篩選的標(biāo)準(zhǔn)對細(xì)胞進(jìn)行篩選也能夠分離出小鼠的IPS細(xì)胞。利用基因重組技術(shù)建立了具有藥物抗性基因的體細(xì)胞，這些細(xì)胞的抗性受內(nèi)源性NANOG或OCT4表達(dá)的調(diào)控。這兩個(gè)基因的作用是維持細(xì)胞多能性，從而利用這種篩選的方法建立了穩(wěn)定的IPS細(xì)胞系，這些細(xì)胞系在各個(gè)方面都表現(xiàn)出了極為相似的特性。,IPS細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展方向,1、利用IPS細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停徊倏v幾個(gè)因子的表達(dá)，加速對多能性調(diào)控機(jī)理的深入研究。2、獲得的方法相對簡單穩(wěn)定，不涉及胚胎的破壞，無倫理道德限制。3、對于疾病機(jī)理研究和新藥開發(fā)等方面將有很大貢獻(xiàn)。4、可望制造特定病人來源的IPS細(xì)胞，用“個(gè)性化”移植來治療諸多疾病。,誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞用于治療小鼠帕金森病,美國麻省WHITEHEAD生物醫(yī)學(xué)研究的WERNIG等近日報(bào)告,通過OCT4、SOX2、KLF4和CMYC四種轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)出的IPS細(xì)胞可分化成神經(jīng)細(xì)胞,可改善帕金森病小鼠的運(yùn)動(dòng)功能。,研究者首先檢驗(yàn)了IPS細(xì)胞在體外的分化能力,發(fā)現(xiàn)IPS細(xì)胞可以分化成神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,并且能夠進(jìn)一步生成神經(jīng)元亞型細(xì)胞,,,未分化的IPS細(xì)胞,IPS細(xì)胞在體外分化成神經(jīng)細(xì)胞,隨后,研究者用熒光物質(zhì)標(biāo)記IPS細(xì)胞,將其入注射入胚胎小鼠的腦室內(nèi)。9周后小鼠出生后,研究者發(fā)現(xiàn),IPS細(xì)胞可遷移到小鼠腦的各個(gè)區(qū)域。,包括腦膜、紋狀體、下丘腦、中腦等部分,并且可分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元,包括谷氨酸性突觸、Γ氨基丁酸能神經(jīng)元和兒茶氨酚能神經(jīng)元等亞型,因?yàn)檫@些分化出的細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài),并且表達(dá)其特異的標(biāo)志物,IPS細(xì)胞植入小鼠大腦后的分布情況,IPS細(xì)胞分化的細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞形態(tài),IPS細(xì)胞分化的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異標(biāo)志物,電生理記錄和形態(tài)學(xué)分析表明,IPS細(xì)胞分化出的神經(jīng)元細(xì)胞植入小鼠體內(nèi)后,具有神經(jīng)元和突觸的形態(tài),參與小鼠的電生理活動(dòng)，因而可增強(qiáng)受植小鼠大腦的神經(jīng)元活性并參與腦功能。,IPS細(xì)胞分化出的神經(jīng)元細(xì)胞可發(fā)生膜電位改變,研究者對小鼠大腦一側(cè)注射神經(jīng)毒性物質(zhì)6羥基多巴胺,使該側(cè)內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的神經(jīng)元死亡。這可破壞該側(cè)大腦紋狀體,即大腦中負(fù)責(zé)運(yùn)動(dòng)控制的區(qū)域,模擬了帕金森病發(fā)生時(shí)的情況。經(jīng)過這樣處理的小鼠運(yùn)動(dòng)控制功能受損,因此無法保持平衡而持續(xù)旋轉(zhuǎn)。,接著，研究者對IPS細(xì)胞進(jìn)行特殊處理,確保這些IPS分化成為多巴胺能神經(jīng)元,將其植入小鼠大腦運(yùn)動(dòng)功能受損的一側(cè)接受6羥基多巴胺注射的一側(cè)。幾周后研究者發(fā)現(xiàn),10只受移植的小鼠中有9只的運(yùn)動(dòng)功能得到顯著改善，其中甚至有1只小鼠受損側(cè)的運(yùn)動(dòng)功能好于未受損側(cè)。,IPS細(xì)胞研究中存在的問題,1、腫瘤相關(guān)基因，如CMYC的使用，有誘發(fā)癌癥的可能2、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染可能會(huì)導(dǎo)致一些癌基因的激活，也可能導(dǎo)致某些重要基因功能受阻。3、基因表達(dá)模式與ESC還存在一些不同。4、效率較低，重組率只有01。,總結(jié),,組內(nèi)同學(xué)的分工,細(xì)胞重編程概況部分演講（陳宇翰），資料（林曉鋒），圖片（梁樂）體細(xì)胞重編程逆轉(zhuǎn)為干細(xì)胞以及誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)機(jī)制部分演講（劉曉暉），資料（余炳強(qiáng)），圖片（林偉鈿）IPS細(xì)胞的研究概況和IPS細(xì)胞系建立的一些重要環(huán)節(jié)部分演講（王珩），資料（林澤江），圖片（羅熙文）IPS細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展方向部分演講（吳逸希）,問答時(shí)間,
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