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簡介：自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血，是當(dāng)今人類致死、致殘的最常見腦血管疾病之一。顱內(nèi)動脈瘤破裂出血，則是最常導(dǎo)致自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的原因，前交通動脈瘤（ANEURYSMOFTHEANTERICOMMUNICATINGARTERY，AACA）約占到顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生率的30％。前交通動脈瘤的發(fā)生位置具有特殊性，在兩側(cè)大腦前動脈之間，而目前對于前交通動脈瘤的治療，還是以外科手術(shù)夾閉及介入栓塞治療為主。因此，前交通動脈瘤破裂后出血刺激及出血后的治療常常直接影響到患者大腦額葉的功能，進(jìn)而影響到患者的認(rèn)知功能。1993年首次提出的血管性認(rèn)知障礙（VCI）的概念，即指由腦血管危險因素（如高血壓、糖尿病和高脂血癥）、明顯（如腦梗死和腦出血）或不明顯的腦血管病（如腦白質(zhì)疏松和慢性腦缺血）引起的從輕度VCI（MVCI）到癡呆的一類綜合征。而國內(nèi)外大多數(shù)關(guān)于血管性認(rèn)知障礙的研究的均集中在缺血性腦血管病方面。而由于近年關(guān)于血管性認(rèn)知功能障礙逐漸成為研究熱點(diǎn)，也有越來越多的學(xué)者將研究對象轉(zhuǎn)向了出血性腦血管疾病，而由前交通動脈瘤治療后引起的認(rèn)知功能障礙具有一定的代表性。目的研究探討前交通動脈瘤本身及手術(shù)夾閉與介入栓塞兩種治療方法對前交通動脈瘤患者認(rèn)知功能的影響。方法①采用簡易精神狀態(tài)量表（MMSE）對206例前交通動脈瘤患者進(jìn)行分析研究，其中開顱動脈瘤夾閉患者125例，介入栓塞患者81例，另取正常組40例作為對照組，對比患者組與對照組MMSE評分的差異。以及采取兩種治療方法后認(rèn)知功能障礙發(fā)生率之間的差異。②根據(jù)患者接受MMSE評分距患者接受治療的時間間隔分為接受治療后六個月、一年、兩年、三年四組，分別對比四組患者認(rèn)知功能障礙發(fā)生率之間的差異。③分析2011年的51例病例的術(shù)前、術(shù)后MMSE評分，了解前交通動脈瘤患者術(shù)前認(rèn)知功能狀況，并對比分析兩組患者術(shù)前、術(shù)后認(rèn)知功能變化。結(jié)果①所有的206例病例中，手術(shù)夾閉組患者認(rèn)知功能障礙發(fā)生率為4960％，介入栓塞組為3457％，二者認(rèn)知功能障礙發(fā)生率經(jīng)Χ2檢驗比較差異顯著（P②根據(jù)患者接受MMSE評分距患者接受治療的時間間隔分成的四組患者認(rèn)知功能障礙發(fā)生率分別為6275％、4444％、2667％、3448％，經(jīng)Χ2檢驗分析后得出它們之間差異顯著（P③分析2011年的51例病例的術(shù)前、術(shù)后MMSE評分均值分別為2671±070，和2416±111，兩者經(jīng)配對樣本T檢驗后，兩者差異顯著（P結(jié)論①前交通動脈瘤患者經(jīng)兩種治療方法后均可能出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，并且接受手術(shù)治療的患者認(rèn)知功能障礙發(fā)生率高于接受介入栓塞治療。②隨著MMSE評分的時間距患者接受治療的時間的增加，患者表現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率在下降。③前交通動脈瘤患者術(shù)前既有認(rèn)知功能障礙發(fā)生，兩種治療手段對術(shù)前即出現(xiàn)的認(rèn)知功能障礙無改善作用，并且可能增加認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率及加重認(rèn)知功能障礙的程度。而介入栓塞對患者的認(rèn)知功能的影響相對手術(shù)夾閉較小。

簡介：該研究通過神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)LACZ基因在神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與表達(dá)成功地建立了以神經(jīng)干細(xì)胞為載體的基因治療方法在該實(shí)驗的研究過程中自胚胎1416D大鼠室管膜下區(qū)及海馬結(jié)構(gòu)中運(yùn)用無血清培養(yǎng)技術(shù)成功地培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞并在EGF、BFGF等細(xì)胞因子的刺激下神經(jīng)干細(xì)胞能在體外進(jìn)行增殖且均為NESTIN陽性細(xì)胞腺病毒能介導(dǎo)LACZ基因在神經(jīng)干細(xì)胞上表達(dá)這一研究為神經(jīng)干細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療提供了堅實(shí)的基礎(chǔ)結(jié)論1、神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)的成功為我們今后研究神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化以及應(yīng)用細(xì)胞移植治療神經(jīng)外科疾病提供了堅實(shí)的基礎(chǔ)2、腺病毒介導(dǎo)LACZ基因在體外的成功連接并在HEK293細(xì)胞上成功的組裝、分泌為我們應(yīng)用基因技術(shù)治療神經(jīng)外科系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)與臨床研究提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)3、腺病毒介導(dǎo)的LACZ基因可轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞并高效表達(dá)同時神經(jīng)干細(xì)胞的形態(tài)、生長特性和增殖能力并不受影響為神經(jīng)干細(xì)胞介導(dǎo)基因治療促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)與再生奠定了基礎(chǔ)

簡介：第一部分大鼠頸部異位心臟移植模型的建立及術(shù)中常見問題的分析和處理目的建立大鼠頸部異位心臟移植模型，分析手術(shù)過程中常見的問題并處理，為快速掌握該技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。方法以SD大鼠為供體，WISTAR大鼠為受體建立大鼠頸部異位心臟移植模型。觀察手術(shù)過程中各環(huán)節(jié)出現(xiàn)的問題并加以改進(jìn)。結(jié)果常見的問題有動靜脈梗阻、出血，心臟不復(fù)跳，麻醉效果差等。經(jīng)過方法的改進(jìn)可以減少和避免問題的出現(xiàn)。結(jié)論只要處理好常見的幾個問題，就可以很快的提高手術(shù)成功率。第二部分HTK液和UW液對大鼠原代心肌細(xì)胞冷保存的保護(hù)作用目的研究HTK液和UW液對體外培養(yǎng)的大鼠原代心肌細(xì)胞冷保存中的保護(hù)作用。方法體外培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞，分別用生理鹽水，UW液和HTK液在0～4℃保存心肌細(xì)胞6H、8H、10H、12H。檢測保存液的AST和LDHL，臺盼藍(lán)染色法計算心肌細(xì)胞的生存率。結(jié)果UW液組和HTK液組的AST和LDHL均比生理鹽水組極顯著低下，心肌細(xì)胞的生存率則極顯著的高于生理鹽水組。而在12H，HTK液組的AST和LDHL顯著低于UW液組，心肌細(xì)胞的生存率在8H和10H也明顯高于UW液組。結(jié)論HTK液和UW液均對體外培養(yǎng)的大鼠原代心肌細(xì)胞的冷保存有明顯的保護(hù)作用。而HTK液相對于UW液更能延長對心肌細(xì)胞的冷保存時間。第三部分1，6二磷酸果糖和HTK液對大鼠原代心肌細(xì)胞冷保存的保護(hù)作用目的研究1，6二磷酸果糖和HTK液在體外培養(yǎng)的大鼠原代心肌細(xì)胞冷保存中的保護(hù)作用。方法體外培養(yǎng)大鼠原代心肌細(xì)胞，分別用生理鹽水A組、1，6二磷酸果糖B組、HTK液C組和1，6二磷酸果糖加HTK液的混合液D組在0～4℃保存心肌細(xì)胞6H、8H、10H。檢測保存液的ALT和LDHL，心肌細(xì)胞NAKATPASE活力，臺盼藍(lán)染色法計算心肌細(xì)胞的生存率。結(jié)果C組和D組的AST、LDHL均比A組和B組顯著低下P＜0001，細(xì)胞的NAKATPASE活力和生存率則顯著提高P＜0001。而在6H，D組的AST、LDHL顯著低于C組P＜001，心肌細(xì)胞的NAKATPASE活力和生存率明顯高于C組P＜001。結(jié)論HTK液和1，6二磷酸果糖加HTK液的混合液均對體外培養(yǎng)的大鼠原代心肌細(xì)胞的冷保存有明顯的保護(hù)作用。而混合液相對于HTK液在短期內(nèi)對心肌細(xì)胞的冷保存有更好的效果。第四部分MIL4基因腺病毒載體的構(gòu)建目的構(gòu)建含MIL4基因的重組腺病毒載體，并在血管內(nèi)皮細(xì)胞中進(jìn)行蛋白表達(dá)鑒定。方法用限制性內(nèi)切酶酶切DFGMIL4NEO質(zhì)粒得到MIL4基因，將MIL4的CDNA插入到腺病毒穿梭質(zhì)粒PADSHUTTLECMV，線性化后與腺病毒骨架載體PADEASY1電穿孔共轉(zhuǎn)染ECOLI菌株BJ5183，使之同源重組，產(chǎn)生腺病毒基因組質(zhì)粒PADMIL4，然后經(jīng)PACⅠ酶切線性化，脂質(zhì)體介導(dǎo)PADMIL4轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝出具有感染力的復(fù)制缺陷型的重組腺病毒載體ADMIL4。擴(kuò)增后收獲病毒，氯化銫密度梯度離心純化，檢測病毒滴度。重組腺病毒感染小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，應(yīng)用ELISA法檢測上清液中MIL4的水平，觀察MIL4蛋白表達(dá)情況。結(jié)果DNA測序分析表明克隆的MIL4基因與文獻(xiàn)報道一致，酶切鑒定證實(shí)MIL4基因正確地插入表達(dá)載體中。重組腺病毒純化后病毒滴度達(dá)到5109PFUML。應(yīng)用ELISA法檢測上清液，MIL4的水平在血管內(nèi)皮細(xì)胞中獲得高效表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建了含有MIL4基因的重組腺病毒載體，重組腺病毒能有效介導(dǎo)MIL4基因在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。第五部分腺病毒載體轉(zhuǎn)染MIL4基因?qū)π∈笠浦残呐K的保護(hù)作用目的研究腺病毒載體轉(zhuǎn)染MIL4基因?qū)π∈笠浦残呐K的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法首先構(gòu)建含有MIL4基因的腺病毒載體，以小鼠頸部心臟移植模型基礎(chǔ)，將ADMIL4經(jīng)冠狀動脈注入供心后，在0～4℃的FDPHTK液的混合液中保存2H，植于小鼠頸部。術(shù)后分別在1D、2D、3D、5D用ELISA法測血清中MIL4的濃度，觀察移植心臟的存活期并行病理學(xué)分析。結(jié)果與空基因的腺病毒組相比較，實(shí)驗組的MIL4濃度明顯升高，移植心臟的中位生存期有所延長。病理學(xué)分析排斥明顯減輕。結(jié)論腺病毒載體轉(zhuǎn)染MIL4基因?qū)π∈笠浦残呐K有保護(hù)作用。

簡介：目的回顧性分析124例病毒性腦炎患者的臨床資料，探討影響其預(yù)后的因素。方法對2001年1月至2006年12月我院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的124例病毒性腦炎患者的臨床表現(xiàn)及輔助檢查結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，對預(yù)后進(jìn)行評估，采用SPSS115統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，探討影響預(yù)后的因素。結(jié)果預(yù)后差的患者意識障礙持續(xù)時間明顯長于預(yù)后好的患者P0001；預(yù)后差的患者多伴有EEG重度異常P005且頭MR病變范圍廣P005。意識障礙持續(xù)時間P0001，31673、頭MR病變范圍P0028，10753及EEG異常程度P0034，21412與預(yù)后顯著相關(guān)。結(jié)論影響病毒性腦炎患者預(yù)后的因素為意識障礙持續(xù)時間、腦電圖異常程度、頭MR病變范圍。

簡介：目的樹突狀細(xì)胞DENDRITICCELLS，DC作為目前發(fā)現(xiàn)的抗原提呈能力最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞，控制著免疫應(yīng)答的性質(zhì)、強(qiáng)度和免疫記憶性。隨著DC體外培養(yǎng)技術(shù)的建立，已有多項研究表明，體外培養(yǎng)的不成熟DC可高效攝取病毒樣顆粒VIRUSLIKEPARTICLES，VLPS，不僅可誘導(dǎo)體液免疫的發(fā)生，而且可通過交叉抗原提呈途徑，激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)。在此過程中，VLPS除作為抗原表達(dá)載體為DC提供了特異性抗原外，還可刺激DC成熟，誘導(dǎo)DC的MHCI和II類分子及一些黏附分子的表達(dá)。因此，用VLPS負(fù)載DC，構(gòu)建DC疫苗，為腫瘤和胞內(nèi)感染病原疫苗的研制開辟了新的途徑。乙肝病毒核心抗原HEPATITISBCE，HBC是乙肝病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，在細(xì)菌、酵母菌及哺乳動物細(xì)胞內(nèi)均能高效表達(dá)、自動裝配成球形顆粒，并可插入外源短肽，同時保持外源肽或表位正確構(gòu)象，有較強(qiáng)免疫原性。因此，用HBCVLPS負(fù)載DC，可能是DC疫苗研究的較好模型。隨人類基因組計劃實(shí)施和推進(jìn)，生命科學(xué)研究進(jìn)入后基因組時代，新的學(xué)科蛋白質(zhì)組學(xué)PROTEOMICS誕生。蛋白質(zhì)組學(xué)可剛來研究細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動態(tài)變化規(guī)律，能從更深一層次認(rèn)識生命活動的規(guī)律?；谏鲜鲈?，在本研究中，我們在原核系統(tǒng)表達(dá)了乙肝核心蛋白，以其組裝成的乙肝核心蛋白病毒樣顆粒HBCVLPS為模型，首次采用能獲得高通量信息的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究DC攝取HBCVLPS后細(xì)胞整體蛋白譜的改變，通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜MATRIXASSISTEDLASERDESPTIONIONIZATIONTIMEOFFLIGHTMASSSPECTROMETRY，MALDITOFMS鑒定得到了有意義的蛋白質(zhì)，為研究DC細(xì)胞活化和DC疫苗的免疫機(jī)制提供了新的線索和思路。方法1乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的制備擴(kuò)增PET28AHBC的工程菌，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，包涵體形式表達(dá)的HBC蛋白的變性、NINTA親和層析純化和復(fù)性。2HBCVLPS的鑒定通過SDSPAGE電泳、蛋白免疫印跡實(shí)驗檢測HBC蛋白的表達(dá)和免疫原性，透射電鏡觀察HBC蛋白VLPS的形成。3小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞的體外培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞由小鼠骨髓獲得經(jīng)細(xì)胞因子RMLL4和RMGMCSF誘導(dǎo)分化成為未成熟BMDC。4BMDC對HBCVLPS的吞噬激光共聚焦顯微鏡觀察不同時間點(diǎn)小鼠BMDC對HBCVLPS的吞噬。5流式細(xì)胞儀分析BMDC表面分子標(biāo)記FITC標(biāo)記的抗小鼠CD11C抗體SDFITC標(biāo)記的抗小鼠CD86、CD80和MHCII分子抗體表面染色后，流式細(xì)胞儀檢測。6細(xì)胞因子的MRNA水平測定常規(guī)方法抽提不同處理組BMDC細(xì)胞的總RNA，將MRNA反轉(zhuǎn)錄為CDNA片段。用合成的細(xì)胞因子IFNΓ、TL12和內(nèi)參照ΒACTIN的引物，擴(kuò)增CDNA片段并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。7BMDC攝取HBCVLPS前后細(xì)胞總體蛋白表達(dá)的差異及差異蛋白的質(zhì)譜分析①攝取HBCVLPS前后BMDC細(xì)胞總蛋白的二維電泳I蛋白樣品的準(zhǔn)備提取細(xì)胞蛋白經(jīng)CLEANUP處理后，BCA法測定蛋白樣品濃度。II二維電泳一向等電聚焦，每根IPG上樣150ΜG，經(jīng)30伏持續(xù)低電壓水化、200伏，1小時除鹽后，梯度升壓、穩(wěn)壓至8000伏，持續(xù)68小時，保證總量為50000伏特小時；二向聚丙烯酰胺凝膠電泳SDSPAGE灌制板膠、將膠條平衡處理后轉(zhuǎn)移至膠板、20MAGEL垂直電泳56小時。Ⅲ硝酸銀染色固定、敏化、漂洗、硝酸銀染色、漂洗、顯色、終止、漂洗、1％乙酸中保存。②蛋白點(diǎn)分析與選取凝膠通過CHEMIIANLGETM5500成像系統(tǒng)獲得數(shù)字化的圖像。使用計算機(jī)應(yīng)用圖像軟件IAMGERMASTERTM50對圖像進(jìn)行分析，選取明顯差異的蛋白點(diǎn)3倍或以上差異。③基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜質(zhì)譜鑒定選取蛋白并在UNIPROT和NCBINR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行肽質(zhì)量搜索，明確它們可能是何種蛋白。8根據(jù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果對膜聯(lián)蛋白A2蛋白的表達(dá)量的變化進(jìn)行WESTENLBLOT實(shí)驗驗證。9體內(nèi)殺傷實(shí)驗①免疫C57BL6小鼠將BMDC與HBCVLPS共孵育24小時，用LPS誘導(dǎo)細(xì)胞成熟，將HBCVLPSBMDC約3106皮下注射小鼠②7天后，取正常C57BL6小鼠脾細(xì)胞，HBC抗原肽刺激8小時后用5NM56羧基熒光素琥珀酰亞胺酯56CARBOXYFLUESCEINNSUCCINIYLESTER，CFSE標(biāo)記。用05NMCFSE標(biāo)記未經(jīng)抗原肽刺激的淋巴細(xì)胞，將高、低濃度標(biāo)記的淋巴細(xì)胞按11比例混合后約34107，靜脈注射給前期免疫的小鼠，12小時后，取脾臟，流式細(xì)胞儀檢測，按下列公式計算CTL殺傷百分率CTL％1CFSEHIGHCFSELOW100。10數(shù)據(jù)統(tǒng)計所有數(shù)據(jù)均用STUDENTSTTEST進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果1原核表達(dá)系統(tǒng)PET28AHBC重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)、NINTA親和層析純化成功得到HBC蛋白。WESTERNBLOT實(shí)驗證實(shí)了變復(fù)性后的蛋白能被抗HBC單抗所特異性地識別。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)HBC蛋白能正確自主組裝成蛋白顆粒，顆粒大小約22NM。2小鼠BMDC的成功培養(yǎng)光學(xué)顯微鏡觀察證實(shí)體外培養(yǎng)BMDC的有DC的典型形態(tài)特征流式細(xì)胞儀檢測BMDC表面標(biāo)志分子CD11C陽性表達(dá)率超過75％。3激光共聚焦顯微鏡觀察到HBCVLPS能快速、大量被BMDC吞噬，表明體外培養(yǎng)的BMDC有較強(qiáng)吞噬能力。4HBCVLPS能誘導(dǎo)BMDC活化，提高其抗原提呈能力流式細(xì)胞儀檢測UNTREATEDBMDC組、HBCVLPSBMDC組、LPSBMDC組的表面標(biāo)記分子CD86表達(dá)率分別為1720％、4245％、4651％，CD80的表達(dá)率分別為1617％、47485％、5658％，MHCII分子的表達(dá)率分別為40423％、63568％、7881％；RTPCR結(jié)果證實(shí)HBCVLPSBMDC組IL12和IFNΓ的MRNA水平明顯高于UNTREATEDBMDC組。5二維電泳檢測負(fù)載HBCVLPS前后BMDC細(xì)胞總蛋白譜的差異表達(dá)。通過IMAGEMASTERTM軟件對凝膠進(jìn)行分析，每張凝膠上檢到500600個點(diǎn)，凝膠間匹配率大于70％。HBCVLPSBMDC組和DPBSBMDC組凝膠之間有8個蛋白點(diǎn)顯示3倍以上表達(dá)量差異。選取其中蛋白表達(dá)量較高的蛋白點(diǎn)6個，進(jìn)行MALDITOF質(zhì)譜鑒定，并在UNIPROT和NCBINR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行肽質(zhì)量搜索，得到4個己知蛋白ISOCITRATEDEHYDROGENASE3NADALPHA、ISOFMCRA_E、GROWTHFACTRECEPTBOUNDPROTEIN2、SIMILARTOEPIPLAKIN、ANNEXINA2。以內(nèi)參ΒACTIN的表達(dá)量為參照，通過WESTERNBLOT驗證發(fā)現(xiàn)BMDC在攝取吞噬HBCVLPS后ANNEXINA2表達(dá)量減少。6體內(nèi)殺靶的方法驗證HBCVLPS負(fù)載的BMDC誘導(dǎo)特異性CTL活性流式細(xì)胞儀檢測熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)，直方圖顯示靶細(xì)胞的百分比M2。在未處理組、PBS處理組、HBCVLPS負(fù)載的BMDC組M2范圍分別為4649％、4751％、1719％。M2與被殺傷靶細(xì)胞的數(shù)量成反比，表明HBCVLPS負(fù)載BMDC組可誘導(dǎo)高水平特異性CTL活性。結(jié)論1從大腸桿菌的包涵體成功獲得了高純度的HBCVLPS。2形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞標(biāo)志分子的檢測表明在體外成功培養(yǎng)出小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞。3激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察證實(shí)，小鼠BMDC可在體外有效攝取HBCVLPS；攝取后BMDC進(jìn)一步成熟與活化細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD86、CD80、MHCII表達(dá)增加，抗原提呈能力增強(qiáng)。4體內(nèi)殺傷實(shí)驗顯示用HBCVLPS負(fù)載的BMDC免疫小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答，CTL活性增強(qiáng)。5二維電泳實(shí)驗發(fā)現(xiàn)HBCVLPSBMDC組和UNTREATEDBMDC組的蛋白譜存在若干表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)。6蛋白質(zhì)譜分析出肽段，再從數(shù)據(jù)庫進(jìn)行肽質(zhì)量搜索，得到4個己知蛋白ISOCITRATEDEHYDROGENASE3NADALPHA，ISOFMCRA_E、SIMILARTOEPIPLAKIN、GROWTHFACTRECEPTBOUNDPROTEIN2、ANNEXINA2。后2個蛋白在細(xì)胞的分化、增值、凋亡等過程中有重要的作用。7蛋白免疫印跡實(shí)驗證實(shí)與PBSBMDC組相比，HBCVLPSBMDC組中蛋白膜聯(lián)蛋白A2ANNEXINA2的表達(dá)量減少，提示DC活化的抑制因素減少，而表現(xiàn)出增強(qiáng)DC生命力的作用，從而增強(qiáng)激活T細(xì)胞的能力。

簡介：分類號密級單位代碼10114學(xué)號20060003呂梁地區(qū)農(nóng)村阿爾茨海默病及輕度認(rèn)知障礙與同型半胱氨酸的關(guān)系研究生孫煌嬗指導(dǎo)教師生41嬡麴援申請學(xué)位門類級別醫(yī)堂亟童些堂魚≥專業(yè)名稱疊經(jīng)痘堂研究方向匭筮夔篷魃痘所在學(xué)院出酉醫(yī)型太堂箍二隆廢醫(yī)堂暄二。一三年五月十四日目錄主要英文縮略語索引I中文摘要II英文摘要Ⅳ正文1前言1日LJ舌L對象和方法。。。。4結(jié)果8討論10結(jié)論。14參考文獻(xiàn)15綜述19正文19參考文獻(xiàn)25附錄30致謝33個人簡介34

簡介：Y1406856中山大學(xué)博士學(xué)位論文腺病毒載體介導(dǎo)的可溶性VEGF受體FLT1SFLT1抑制多發(fā)性硬化單核／巨噬細(xì)胞浸潤的實(shí)驗研究ADENOVIRUSMEDIATEDSOLUBLEVEGFRECEPTORFLTISFIT11GENEDELIVERYINHIBITSMONOCYTELINEAGECELLSRECRUITMENTINEXPERIMENTALAUTOIMMUNEENCEPHALOMYELITIS博士研究生朱燦勝學(xué)科、專業(yè)神經(jīng)病學(xué)導(dǎo)師胡學(xué)強(qiáng)教授答辯委員會主席答辯委員會委員中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院廣州二OO七年六月二日中山大學(xué)博士學(xué)位論文競爭結(jié)合VEGF，并且能與膜表面受體FIT．1及KDR形成同源或異源二聚體，中止活化信號的傳遞，從而阻斷VEGF的生物學(xué)活性，因此SFLT．1可能是VEGF體內(nèi)天然抑制劑。目前國外已有利用SFLT．1進(jìn)行抑瘤研究的報道，且收效較為顯著。VEGF對單核細(xì)胞具有趨化作用，誘導(dǎo)其遷移。單核／巨噬細(xì)胞表達(dá)FIT．1，在受到巨噬細(xì)胞抗原刺激后表達(dá)上調(diào)。VEGF的趨化作用認(rèn)為是通過這一受體實(shí)現(xiàn)的。因此，利用VEGF體內(nèi)天然抑制劑SFLT．1可以在體內(nèi)封閉MSCNS內(nèi)升高的VEGF，抑制其對炎癥細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞的趨化作用，從而達(dá)到治療的目的。研究方法1通過PCR方法擴(kuò)增SFLT．113基因，然后應(yīng)用腺病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建攜帶人SFLT．1／FLAG融合基因的重組腺病毒載體AD．SFLT．1／FLAG。應(yīng)用ELISA、免疫組織化學(xué)、免疫熒光化學(xué)和WESTERN．BLOT法檢測所構(gòu)建的重組腺病毒載體在真核細(xì)胞中的表達(dá)。通過TRANSWELL巨噬細(xì)胞趨化實(shí)驗和MATRIGELPLUG分析，進(jìn)一步證實(shí)重組腺病毒所表達(dá)目的的生物學(xué)功能；2選取DA大鼠作為實(shí)驗動物，應(yīng)用豚鼠脊髓加完全福氏佐劑制成勻漿誘導(dǎo)EAE模型；3應(yīng)用FERIDEXMRI檢查監(jiān)測EAECNS內(nèi)單核／巨噬細(xì)胞的浸潤情況；4通過側(cè)腦室注射AD．SFLT．1／FLAG阻止EAECNS內(nèi)單核／巨噬細(xì)胞浸潤，并通過發(fā)病情況、病理改變、免疫組織化學(xué)、免疫熒光化學(xué)觀察，評價治療效果結(jié)果成功構(gòu)建了AD．SFLT一1／FLAG，PCR檢測證實(shí)無野生型腺病毒及腺相關(guān)病毒的污染，ELISA、免疫組織化學(xué)、免疫熒光化學(xué)和WESTERN．BLOT法檢測顯示所構(gòu)建的腺病毒載體攜帶的基因能夠在真核細(xì)胞中得到表達(dá)。TRANSWELL巨噬細(xì)胞趨化實(shí)驗和MMRIGELPLUG分析顯示VEGF對巨噬細(xì)胞具有趨化作用，而SFLT．1蛋白具有抑制VEGF對巨噬細(xì)胞趨化作用。選擇DA大鼠可成功誘導(dǎo)EAE模型，通過常規(guī)MRI檢查可發(fā)現(xiàn)EAE動物模型腦部病灶，F(xiàn)ERIDEX增強(qiáng)MⅪ檢查可以監(jiān)測EAECNS巨噬細(xì)胞浸潤情況。AD．SFLT．1／FLAG側(cè)腦室注射組動物發(fā)病率為50％，臨床評分為2．0士1．OO，與側(cè)腦室注射PBS發(fā)病率100％，臨床評分3．4士1．07和AD．EGFP發(fā)病率87．5％，臨床評分3．3士0．97組相比，差異具有顯著性。免疫組化及免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)EAECNS組織，尤其是脊髓，有大量的VEGF表達(dá)細(xì)胞，主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞，同時有伴有巨噬細(xì)胞浸潤。AD．SFLT．1／FLAG側(cè)腦室注射可以抑制EAECNS內(nèi)單核／巨噬細(xì)胞的浸潤，從而降低EAE的發(fā)病率和改善EAE病情。結(jié)論本研究成功構(gòu)建了人SFLT．1基因重組腺病毒ADSFLT．1／FLAG，并融合FLAG標(biāo)簽；VEGF對巨噬細(xì)胞具有趨化作用；可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體FLT．1SFLT．1具有抑制VEGF對巨噬細(xì)胞趨化的作用；FERIDEX增強(qiáng)M對檢查可以監(jiān)測

簡介：第一部分冠脈內(nèi)注射病毒轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞生長因子對冠心病患者外周造血干細(xì)胞的動員作用。目的探討經(jīng)冠脈內(nèi)注射腺病毒ADENOVIRUS，AD轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞生長因了HEPATOCYTEGROWTHFACTHGF對嚴(yán)重冠狀動脈狹窄的患者外周造血干細(xì)胞的動員作用。方法本研究入選18例冠心病患者分為兩組給藥組經(jīng)冠脈注入ADSHGF9例和對照組經(jīng)冠脈注入等量生理鹽水9例。所有患者均于冠脈造影OH即術(shù)前、術(shù)后6H、24H、6D抽取外周血并應(yīng)用流式細(xì)胞儀單克隆熒光抗體標(biāo)記法檢測其外周造血干細(xì)胞表面抗原CD34、CD38及CD117。結(jié)果經(jīng)冠脈內(nèi)給藥組術(shù)后6小時的CD34明顯高于對照組0104±0082VS0022±0012，P0021，OH、24H及6D的CD34兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；經(jīng)冠脈內(nèi)給藥組術(shù)后6天的CD117明顯高于對照組0058±058VS00120009，P0034，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其余時間點(diǎn)兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；CD38在各時間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論經(jīng)冠脈內(nèi)注射轉(zhuǎn)染腺病毒攜帶人HGF可能在短時間引起外周造血干細(xì)胞的動員。動員外周造血干細(xì)胞可能是HGF參與血管新生和器官組織損傷修復(fù)及抗調(diào)亡改善心功能的一個重要機(jī)制。第二部分冠脈內(nèi)注射與心肌內(nèi)注射腺病毒轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞生長因子對冠心病患者外周造血干細(xì)胞的動員作用。目的為了研究對嚴(yán)重病變的冠心病患者經(jīng)心肌內(nèi)注射及經(jīng)非梗死相關(guān)冠脈注入轉(zhuǎn)染腺病毒ADENOVIRUS，AD攜帶人肝細(xì)胞生長因子HEPATOCYTEGROWTHFACTHGF對外周血CD34、CD117的動員作用，并比較其差異。方法本研究入選12例冠心病患者分為兩組經(jīng)心肌內(nèi)注射組6例和經(jīng)相關(guān)的冠脈注入組6例。所有患者均行冠狀動脈造影術(shù)，并于OH即術(shù)前、術(shù)后6H、24H及6D抽取外周血并應(yīng)用流式細(xì)胞儀單克隆熒光抗體標(biāo)記法檢測其造血干細(xì)胞表面抗原CD34、CDLL7。結(jié)果1流式細(xì)胞儀單克隆熒光抗體標(biāo)記顯示CD3424H時的經(jīng)非梗死的冠脈內(nèi)給藥組明顯高于心肌內(nèi)注射組P0042，在給藥后24H內(nèi)呈增加的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義；CD117與術(shù)后6H及24H時經(jīng)非梗死的冠脈內(nèi)給藥組明顯高于心肌內(nèi)注射組P0018P0030有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，在兩組給藥后呈增加的趨勢，無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論經(jīng)冠脈內(nèi)注射轉(zhuǎn)染腺病毒攜帶人HGF比心肌內(nèi)注射能明顯的動員外周造血干細(xì)胞。動員外周造血干細(xì)胞可能是HGF參與血管新生、平滑肌的遷移和器官組織損傷修復(fù)等的一個重要機(jī)制。

簡介：知覺是人腦對于客觀事物綜合的，整體的反應(yīng)。知覺的形成源于感覺通道自下而上地對事物個別屬性的信息編碼與傳遞，也依賴于主體的知識與經(jīng)驗的自上而下的指導(dǎo)。這給視知覺形成過程提供一個概念構(gòu)架。神經(jīng)生理學(xué)對于視神經(jīng)系統(tǒng)的研究為視知覺形成過程提供了物質(zhì)構(gòu)架。但是對于視知覺信息加工過程本身，尤其是視覺初級加工和高級加工的相互關(guān)系，以及注意在視知覺中的作用缺乏綜合的，定量的實(shí)驗研究。本研究在圖形任務(wù)中結(jié)合對不同加工階段起作用的因素，如對初級加工階段影響較大的明度與視角因素，對知覺加工影響較大的立體朝向，實(shí)點(diǎn)位置；不同的視知覺任務(wù)，如整體任務(wù)和局部任務(wù)，絕對判斷和相對比較；以及綜合行為指標(biāo)和眼動指標(biāo)，力求對視知覺的加工層次有更清晰的定量描述。得到結(jié)果如下1視知覺存在初級加工和高級加工階段，各階段間有獨(dú)立性，也有聯(lián)動性。2知覺層次的加工更多影響注視次數(shù)，初級加工更多影響注視時間。3注意資源分配影響注視時間，一般注意資源分配越多，注視時間越長。但在“材料限制”下，作用可能相反。4男女在視知覺方式上有差異。比起女生，男生對知覺層次的信息量更加敏感，且更易形成整體知覺。而女生比男生更加善于觀察和辨認(rèn)細(xì)小特征。5認(rèn)知任務(wù)的明確存在與否，影響人的觀察方式。在消極觀察下，被試更傾向于保持一定的喚醒水平，對易于判斷的圖形更多注視。而有認(rèn)知任務(wù)時，被試對較難判斷的圖形注視較多。6視覺對于刺激的變化敏感。任務(wù)為絕對判斷時，目標(biāo)特征的變化需要較少注意資源；無關(guān)干擾使所需注意資源變大，目標(biāo)變化與無關(guān)干擾的作用相互獨(dú)立。任務(wù)為相對比較時，目標(biāo)與干擾的作用為交互，在有干擾時，目標(biāo)特征的變化使所需注意資源不降反升。7對整體的知覺是不隨意，自動發(fā)生的；對局部細(xì)節(jié)特征的辨識不是自動發(fā)生的。整體知覺影響對細(xì)節(jié)特征的辨識，但沒有相反的作用。8固定的眼動頻率會被存儲，在自主觀察時會以相同注視時間發(fā)生眼動。

簡介：點(diǎn)擊查看更多人巨細(xì)胞病毒感染致小鼠腦組織同源盒基因表達(dá)改變的研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：南華大學(xué)碩士學(xué)位論文PIG11基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其高表達(dá)對HEPG2細(xì)胞凋亡的影響姓名吳艷申請學(xué)位級別碩士專業(yè)病理學(xué)與病理生理學(xué)指導(dǎo)教師梁曉秋200705014PIG11基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及其高表達(dá)對HEPG2細(xì)胞凋亡的影響碩士研究生吳艷導(dǎo)師梁曉秋教授中文摘要目的構(gòu)建人PIG11逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，建立高表達(dá)PIG11基因的HEPG2細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究PIG11基因在肝癌細(xì)胞中的功能及促凋亡作用提供一個理想的試驗平臺。觀察PIG11基因高表達(dá)對HEPG2細(xì)胞凋亡的影響。方法將已有的PCDNA31/NTGFPPIG11質(zhì)粒用PCR法擴(kuò)增出PIG11片段，經(jīng)過酶切、T4DNA聚合酶連接等步驟將該片段重組入PLXSN逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，構(gòu)建含人PIG11CDNA的重組質(zhì)粒PLXSNPIG11。重組載體經(jīng)PCR鑒定和DNA測序分析。將該重組質(zhì)粒用LIPOFECTAMINETM2000轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞PA317，獲得PLXSNPIG11逆轉(zhuǎn)錄病毒液。用病毒液感染NIH3T3細(xì)胞，檢測病毒滴度。再用病毒液感染HEPG2細(xì)胞，G418篩選，獲得PIG11高表達(dá)的HEPG2細(xì)胞株。應(yīng)用RTPCR和WESTERNBLOT檢測經(jīng)感染后HEPG2細(xì)胞的PIG11表達(dá)。對成功感染PIG11基因的HEPG2細(xì)胞應(yīng)用HE染色、DNALADDER以及流式細(xì)胞儀檢測等方法測定PIG11在HEPG2中高表達(dá)時對該細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果成功構(gòu)建了PLXSNPIG11逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，測序證明PIG11CDNA編碼序列與GENBANK中報道的一致。轉(zhuǎn)染PA317細(xì)胞后病毒釋放，經(jīng)檢驗病毒滴度為1105CFU/ML。用含病毒上清液感染HEPG2細(xì)胞，經(jīng)RTPCR和WESTERNBLOT檢測證實(shí)HEPG2細(xì)胞中PIG11MRNA及PIG11蛋白表達(dá)明顯升高。高表達(dá)PIG11的HEPG2細(xì)胞從形態(tài)學(xué)上可觀察到凋亡細(xì)胞增多，有明顯的DNALADDER條帶。流式細(xì)胞儀檢測顯示感染PIG11的HEPG2細(xì)胞凋亡率為4113±229，明顯高于未處理組細(xì)胞的凋亡率333±081和感染空載體細(xì)胞的凋亡率353±

簡介：Y784003中圖分類號R512．6．2瀘糾匿學(xué)陀研究生碩士學(xué)位論文PSIHBWX抵制乙肝病毒復(fù)制和表達(dá)的研究PTZU6I經(jīng)限制性內(nèi)切酶SALI和XBAI酶切后，暴露SALI和XBA，酶切位點(diǎn)，直接與純化好的雙鏈DNA定向粘端連接，即構(gòu)建好轉(zhuǎn)錄針對X基因轉(zhuǎn)錄體的發(fā)夾狀SIRNA轉(zhuǎn)錄載體PSIHBV／X。根據(jù)核酸分析軟件DNASSIST2．0的分析，重組體PSIHBV／X如下特點(diǎn)1．SALI酶切位點(diǎn)消失，故不能被該內(nèi)切酶消化，仍為環(huán)狀質(zhì)粒；2．XBAI位點(diǎn)存在，可被其切成約3．2KB大小的線狀DNA鏈；3．可被HIN卿＆以，切為2800BP和395BP的兩個片斷。酶切后1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示重組體符合如上特點(diǎn)，然后再將重組體提交給生物公司測序鑒定，結(jié)果證實(shí)重組體中含有克隆的目的片斷。至此，能在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄針對HBVX基因轉(zhuǎn)錄體的發(fā)夾狀SIRNA轉(zhuǎn)錄載體PSIH3V／X構(gòu)建成功。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法將PHBVL．3與PSIHBV／X按L1、120的比例共轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞株HEPG2，同時設(shè)立感染對照組只轉(zhuǎn)染相同劑量的PHBVL．3，不加任何SIRNA和無關(guān)對照組PHBVL．3與無關(guān)SIRRA轉(zhuǎn)錄載體PSIGFP共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后分別于24H、48H、72H收集細(xì)胞上清液，使用ELISA法半定量HBEAG和HBSAG的含量，酶標(biāo)儀讀出吸光度數(shù)值，結(jié)果用實(shí)驗孔吸光度A值／X寸照孔A值S肘值，S表示待測樣品，N表示陰性對照表示，IMEAGS／N值≥1．0、IMSAGS／N值≥2．0為陽性，計算PSIHBV／X對上述兩種抗原的抑制率。使用熒光定量PCR法觀察72H時HBVDNA含量的變化，由計算機(jī)軟件自動分析計算出定量結(jié)果，采用計算機(jī)對數(shù)平均值的方法計算HBVDNA平均拷貝數(shù)；實(shí)驗數(shù)據(jù)以夏±S表示，由SPSS10．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，多組間單因素方差分析得出P值。分析上述結(jié)果，觀察PSIHBV／X對HBV的復(fù)制和抗原表達(dá)的抑制效

簡介：丙型肝炎病毒HCV感染所引起的丙型肝炎呈全球分布。據(jù)WHO估計，目前全世界約有18億HCV感染者，且呈增長趨勢。HCV是單股正鏈RNA病毒，HCV感染所致的丙型肝炎慢性化率高達(dá)75％～85％，可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細(xì)胞癌，對人類的健康和生命構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。丙型肝炎病毒屬黃病毒屬，全長約96KB，為一單股正鏈RNA，分為5’非翻譯區(qū)UTR、一個開放讀碼框F和3’非翻譯區(qū)，編碼一個由3000多個氨基酸組成的復(fù)合蛋白前體，在宿主信號肽酶和病毒蛋白酶的作用下裂解產(chǎn)生至少10種基因產(chǎn)物四種結(jié)構(gòu)蛋白CE，E1，E2，P7和六種非結(jié)構(gòu)蛋白NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B。而在HCV編碼的十幾種蛋白中，核心蛋白CE是HCV多聚蛋白前體經(jīng)細(xì)胞信號肽酶剪切而產(chǎn)生的非糖基化蛋白，由191個氨基酸組成。該蛋白的氨基酸序列十分保守，具有調(diào)控多種細(xì)胞基因，影響細(xì)胞生長、增生及凋亡的能力。近年來外國學(xué)者在感染HCV的患者血清中發(fā)現(xiàn)了HCVF蛋白，是由HCV核心基因編碼的另一個產(chǎn)物，它是由核心基因密碼子核苷酸移位后產(chǎn)生的。其在HCV不同基因型的高度保守性和在患者體內(nèi)抗體的存在，顯示F蛋白在HCV生命周期中起重要作用。為了研究此種蛋白抗體在我國丙肝人群是否同樣存在及其分布情況，探討F抗體與HCV感染之間的關(guān)系。本文進(jìn)行了如下研究第一部分丙型肝炎病毒F蛋白重組基因片段的克隆及其在細(xì)菌中的表達(dá)根據(jù)GENBANK提供的HCV1B序列設(shè)計引物，擴(kuò)增F蛋白基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后，與用BAMHⅠ和ECⅠ雙酶切，電泳回收后與用上述雙酶切割并電泳回收的PGEX4T2質(zhì)粒連接，獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞。PCR鑒定可擴(kuò)增出與目的片段大小一致的DNA片段。同時提取重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定與比對分析，結(jié)果證實(shí)DNA插入序列正確。對構(gòu)建的重組工程菌用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDSPAGE電泳分析顯示HCVFGSTGLUTATHIONESTRANSFERASE特異性表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為43KD，表達(dá)量占菌體蛋白的15％左右。本研究成功構(gòu)建了表達(dá)丙型肝炎F蛋白重組基因片段的工程菌，為獲得抗原性強(qiáng)、特異性好的F蛋白抗原奠定了基礎(chǔ)。第二部分丙型肝炎病毒重組F表達(dá)蛋白的純化與初步鑒定將HCVFGST重組工程菌大量培養(yǎng)后加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收菌并超聲破碎后進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測，證實(shí)表達(dá)蛋白為可溶性蛋白。將超聲裂解上清置入GLUTATHIONESEPHAROSE4B親和層析柱中，用洗脫液還原型谷胱甘肽洗脫。收集洗脫下來的蛋白溶液，進(jìn)行SDSPAGE鑒定，并用紫外分光光度計測定蛋白濃度，于30℃保存?zhèn)溆?。同時轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒PGEX4T2入大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)GST蛋白，并進(jìn)行GLUTATHIONESEPLAAROSE4B親和層析柱純化。將純化獲得的HCVFGST融合表達(dá)蛋白作抗原，稀釋后包被酶聯(lián)反應(yīng)板，ELISA間接法檢測已知的4份抗HCV陽性血清、4份正常人血清。結(jié)果顯示此表達(dá)蛋白能與3份抗HCV陽性血清反應(yīng)，而與1份抗HCV陽性血清和正常人血清不發(fā)生反應(yīng)。同時WESTERNBLOT分析也證實(shí)此蛋白抗原能與陽性血清抗體發(fā)生特異性結(jié)合。以上結(jié)果初步說明該融合表達(dá)蛋白制備、純化較容易，并與丙肝病人血清出現(xiàn)特異性反應(yīng)。本研究建立了表達(dá)蛋白的純化方法，并純化獲得了具有良好抗原性的HCVFGST蛋白抗原。第三部分用HCVFGST蛋白做為抗原檢測丙肝病人血清抗體將純化后的重組表達(dá)蛋白HCVFGST作為抗原包被酶聯(lián)反應(yīng)板，以待測血清標(biāo)本為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IGG抗體為二抗，以GST蛋白孔作為本底對照，ELISA間接法分別檢測120份抗HCV陽性血清、10份正常人血清。結(jié)果重組蛋白與82份的抗HCV陽性血清均可發(fā)生特異性反應(yīng)抗體陽性率68％，而與10份正常人血清不起反應(yīng)。病例組與對照組有統(tǒng)計學(xué)差異P001。發(fā)現(xiàn)50歲以上年齡組抗HCVF抗體的陽性率高于20～50歲年齡組，有統(tǒng)計學(xué)差異P001；中重度和肝硬化患者陽性率最高P005；抗HCVF抗體在男性和女性患者中的檢出無統(tǒng)計學(xué)差異；且與患者血清中HCVRNA的檢出無統(tǒng)計學(xué)差異P0099，而在HCVRNA各型別之間的檢出亦無統(tǒng)計學(xué)差異P0926。以上結(jié)果表明該融合表達(dá)蛋白具有較好的抗原性和特異性。本研究建立了以ELISA間接法為基礎(chǔ)的HCVFGST抗體檢測方法，并對檢測試劑、反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。第四部分HCVFGST多克隆抗體的制備將純化后的重組表達(dá)蛋白HCVFGST作為抗原免疫BALBC小鼠，取鼠尾血用間接ELISA法檢測抗HCVF抗體效價≥110000。加強(qiáng)免疫后摘眼球取血，分離血清。WESTERNBLOT分析證實(shí)此免疫后血清可與HCVFGST蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，正常小鼠血清不與此蛋白發(fā)生反應(yīng)。結(jié)果表明該免疫血清與HCVFGST有良好的免疫反應(yīng)性，為進(jìn)一步研究HCVF蛋白在HCV感染和病程中的作用提供了實(shí)驗基礎(chǔ)。

簡介：本研究系統(tǒng)地應(yīng)用狗腎細(xì)胞MDCK細(xì)胞模型和小鼠模型對中藥復(fù)方銀芩膠囊和芩連膠囊及重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子RHUGMCSF進(jìn)行了體內(nèi)、外的抗流感病毒作用的實(shí)驗研究。體外實(shí)驗以MDCK細(xì)胞為模型，采用MTT法檢測藥物對細(xì)胞存活率的影響，即藥物毒性濃度測定；以藥物對流感病毒導(dǎo)致的細(xì)胞病變CYTOPATHICEFFECT，CPE的抑制率為指標(biāo)，確定藥物體外抗流感病毒有效濃度。結(jié)果顯示，銀芩膠囊和芩連膠囊在體外均可有效抑制流感病毒相關(guān)CPE的形成。銀芩膠囊的最大無毒濃度TCO為125MGML，50﹪毒性濃度TCSO為89MGML，對流感病毒50﹪有效抑制濃度ICSO為04MG／ML，治療指數(shù)TI達(dá)225。芩連膠囊的TCO為125ΜGML，TCSO為2818ΜMGML，ICSO為670ΜMGML，TL值為42?？紤]到RHUGMCSF是通過受體細(xì)胞發(fā)揮牛物學(xué)活性，因此采用從人抗凝靜脈血中分離的外周血單個核細(xì)胞PBMC為受體細(xì)胞，將PBMC在體外與RHUGMCSF共培養(yǎng)3天后，收集細(xì)胞上清液進(jìn)行抗流感病毒體外實(shí)驗結(jié)果顯示，PBMC與80ΜMGML及以上濃度的RHUGMCSF共培養(yǎng)后，其細(xì)胞上清對CPE的抑制率可超過50﹪。RHUGMCSF的TCO為200ΜMGML，TCSO為3090ΜG／ML，ICSO為644ΜG／ML，TL值為48。體內(nèi)實(shí)驗以昆明種小鼠為動物模型，小鼠感染病毒后2小時開始給藥，銀芩膠囊和芩連膠囊都采用口服給藥銀芩膠囊每日2次，芩連膠囊每日1次，共連續(xù)給藥六天，從感染之日起連續(xù)觀察14天。RHUGMCSF采用預(yù)防性治療給藥的方式，在小鼠感染病毒前先滴鼻給藥7天，每日1次，接種病毒后再滴鼻給藥3天，從感染之日起連續(xù)觀察14天。通過流感病毒感染小鼠的死亡率、牛命延長情況及肺病變程度指標(biāo)判定其抗流感病毒作用。結(jié)果表明，試驗藥物均能減少流感病毒感染小鼠的死亡率，延長存活時間，減輕小鼠肺組織病變程度。口服10、03和01GKGD銀芩膠囊，對流感病毒感染小鼠的死亡保護(hù)率分別為40﹪、20﹪和5﹪，牛命延長率分別為661﹪、327﹪和248﹪，減輕小鼠肺病變分別為769﹪、539﹪和385﹪?？诜?、2、L、05和O25G／KGD芩連膠囊，對流感病毒感染小鼠的死亡保護(hù)率分別為40﹪、30﹪、30﹪、20﹪和O﹪，牛命延長率分別為832﹪、701﹪、645﹪、402﹪和75﹪，口服芩連膠囊4、1和05G／KG／D，減輕小鼠肺病變分別為514﹪、258﹪和82﹪。鼻腔途徑給予134、067和034MG／KGD的RHUGMCSF，對流感病毒感染小鼠的死亡保護(hù)率分別為80﹪、55﹪和50﹪，牛命延長率分別為1158﹪、746﹪和658﹪，減輕小鼠肺病變分別為400﹪、348﹪和48﹪。以上實(shí)驗數(shù)據(jù)表明，銀芩膠囊和芩連膠囊具有直接抑制流感病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的作用，并且對模型小鼠的病毒性肺炎療效顯著，能有效降低感染小鼠的死亡率，延長存活時問和減輕小鼠肺組織病變程度。RHUGMCSF經(jīng)受體細(xì)胞介導(dǎo)后可產(chǎn)牛抗流感病毒活性，采用經(jīng)鼻途徑預(yù)防性給藥治療方式亦可對模型小鼠產(chǎn)牛顯著的保護(hù)作用。這些實(shí)驗結(jié)果為銀芩膠囊和芩連膠囊的治療功效提供了抗流感病毒的實(shí)驗依據(jù)，為其開展臨床試驗提供了有力的支持，并且首次表明了免疫調(diào)節(jié)劑RHUGMCSF具有抗流感病毒的作用，本研究取得的結(jié)果也為建立抗流感病毒藥物療效和機(jī)制研究的平臺奠定了重要的工作基礎(chǔ)。

簡介：浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文SARS冠狀病毒的基因組變異與進(jìn)化研究姓名商磊申請學(xué)位級別碩士專業(yè)微生物學(xué)指導(dǎo)教師馮明光于軍20050501SARS冠狀病毒基因組的變異和進(jìn)化研究摘要2003年3月，一種新的冠狀病毒COVSARS冠狀病毒被確認(rèn)為引起SARSSCVEREACUTERESPIRATORYSYNDROME的病原。在本研究中，我們獲取了LO株直接來源SARS病人糞便或咽拭予樣本及其細(xì)胞傳代培養(yǎng)物的SARSCOV全基因組序列，并會同公共數(shù)據(jù)庫中的115株SARSCOV基因組序列進(jìn)行了系統(tǒng)地比較分析。以GZ02序列為參照，發(fā)現(xiàn)266個在2個以上基因組中同時存在的單核營酸多態(tài)SNP位點(diǎn)。這些多態(tài)位點(diǎn)在SARSCOV基因組中呈偏態(tài)分布。同時發(fā)現(xiàn)了18種主要的缺失類型和2種主要的插入類型，定義了2種與發(fā)病時期及致死率相關(guān)的基因型。S蛋白在發(fā)病早期受到最大的正向選擇壓力，然后逐步穩(wěn)定下來。我們應(yīng)用鄰位連接法NCIGHBORJOINING構(gòu)建了125株SARSCOV的親緣樹。通過來源于同一病人的直接取樣樣本及其細(xì)胞傳代培養(yǎng)物的SARSCOV基因組序列對比分析發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中SARSCOV基因組序列幾乎不會產(chǎn)生突變，但取樣時間策略將會影響這一過程。推測這種現(xiàn)象有可能是由于細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程會選擇出某種優(yōu)勢株病毒造成的。關(guān)鍵司SARS冠狀病毒基因組；單核苷酸多態(tài)性；插入缺失；正向選擇壓力