1、目的:
　　腫瘤(tumor)是生物機(jī)體在各種生物、理化等各種致瘤因素的作用下，組織中的某單一細(xì)胞在遺傳學(xué)或表觀(guān)遺傳學(xué)水平上失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，進(jìn)而導(dǎo)致單細(xì)胞克隆性異常增生而產(chǎn)生的新生物。腫瘤常分為良性和惡性?xún)纱箢?lèi)，通常所謂的“癌癥”是生物體內(nèi)所有的惡性腫瘤的統(tǒng)稱(chēng)。
　　微小RNA(microRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，在眾多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，例如胚胎發(fā)育、組織器官形成

2、、病毒防御、細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展等。miRNA可以通過(guò)與靶基因mRNA3'-UTR的特定位點(diǎn)結(jié)合，遏制其翻譯過(guò)程或誘導(dǎo)其降解，從而參與基因的表達(dá)調(diào)控。miRNA可參與腫瘤相關(guān)的多種信號(hào)通路，與腫瘤的產(chǎn)生、增值、侵襲、轉(zhuǎn)移等過(guò)程密切相關(guān)。目前，諸多文獻(xiàn)報(bào)道乳腺癌中多種miRNAs表達(dá)異常，例如miR-200、let-7和miR-10b。因此，進(jìn)一步研究miRNA在乳腺癌中的表達(dá)水平及其功能有利于我們更好的理解乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，并

3、力求找到能有效防控腫瘤發(fā)生發(fā)展的新策略。
　　Six1首先在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，作為Six家族成員之一，發(fā)揮著類(lèi)似于其家族成員所擁有的廣泛而又強(qiáng)大的作用。目前為止，Six1的研究對(duì)理解腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有重要意義，同時(shí)為腫瘤診斷及治療提供潛在的的靶點(diǎn)。
　　本課題首先利用生物信息學(xué)技術(shù)，同時(shí)使用三種在線(xiàn)生物信息學(xué)軟件TargetScan，mirDIP及miRDB協(xié)同篩查，篩選出miR-204-5p潛在的下游靶基因，并綜合挑選評(píng)分?jǐn)?shù)

4、較高的100個(gè)潛在靶點(diǎn)，剔除已有研究報(bào)道證實(shí)的靶點(diǎn)，進(jìn)一步利用雙熒光素酶及免疫印跡實(shí)驗(yàn)等技術(shù)對(duì)挑選的的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。并結(jié)合臨床標(biāo)本，利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)miR-204-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)水平，同時(shí)通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)相應(yīng)靶基因在相同乳腺癌組織中的表達(dá)水平。其次通過(guò)體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)來(lái)研究miR-204-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞增值、遷移及侵襲等多種生物學(xué)行為的影響。由于Six1具有轉(zhuǎn)錄因子功能，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其

5、可能對(duì)miR-204-5p及相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，以期闡明其在乳腺癌中發(fā)揮作用的分子機(jī)制。本課題的研究成果將進(jìn)一步加深我們對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的了解，為乳腺癌的早期診斷及治療提供新的策略，或可以為此疾病的新藥研發(fā)提供關(guān)鍵的分子靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.miR-204-5p下游靶基因的預(yù)測(cè)及對(duì)靶基因Six1調(diào)節(jié)作用的研究
　　通過(guò)miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站包括TargetScan、mirDIP、miRBase對(duì)miR-

6、204-5p可能的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。2.以MCF-7細(xì)胞總RNA為模板，擴(kuò)增基因Six1 mRNA3'-UTR序列，連接psiCHECKTM-2載體，構(gòu)建psiCHECKTM--Six1-3-UTR野生型熒光素酶重組質(zhì)粒。3.以psiCHECKTM-2-Six1-3'-UTR重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行亞克隆。采用SOE的方法，擴(kuò)增Six1-3'-UTR突變型重組質(zhì)粒，包括psiCHECKTM-2-Six1-3'-UTR-Mut-1+Mut-2

7、、psiCHECKTM-2-Six1-3'-TR-Mut-1、psiCHECKTM-2-Six1-3'-UTR-Mut-2。4.采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶基因的確認(rèn)。設(shè)計(jì)miR-204-5p mimic組、mimic NC組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別轉(zhuǎn)染293T、MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，48h后收集各組熒光信號(hào)，實(shí)驗(yàn)采用One-WayANOVA統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析。
　　2.miR-204-5p及Six1在乳腺癌中的表達(dá)及意

8、義
　　收集30例乳腺癌新鮮臨床標(biāo)本，分別采用原位雜交技術(shù)(in situ hybridization，ISH)和免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)miR-204-5p和Six1在相同連續(xù)乳腺癌組織切片中的表達(dá)水平，并分析兩者表達(dá)關(guān)聯(lián)性及獨(dú)立臨床意義。
　　3.miR-204-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　(1)實(shí)驗(yàn)分為兩組:MCF-7-NC細(xì)胞組（陰性對(duì)照）、MCF-7-

9、miR-204細(xì)胞組（實(shí)驗(yàn)組）。
　　(2)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并繪制0h、12h、24h及48h出各組細(xì)胞生長(zhǎng)增殖曲線(xiàn)，評(píng)估m(xù)iR-204-5p對(duì)于MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　(3)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7各組細(xì)胞遷移能力，評(píng)估過(guò)表達(dá)miR-204-5p對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響。
　　(4)Matrigel-Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并獲取各組乳腺癌細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)圖，評(píng)價(jià)miR-204

10、-5p對(duì)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　4.Six1/miR-204-5p反饋調(diào)節(jié)分子機(jī)制的研究
　　(1)以MCF-7細(xì)胞總RNA為模板，擴(kuò)增基因Six1 mRNA CDs序列并構(gòu)建pcDNA-3.1-Six1重組質(zhì)粒。
　　(2)分別用NC、Six1-siRNA1，Six1-siRNA2、pcDNA3.0-Six1轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組miR-204-

11、5p的表達(dá)量，并分析其意義。
　　(3)并且分別用mimics NC、miR-204-5p mimics、siRNA1、siRNA2、Six1+siRNA1、Six1+siRNA2轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞株，免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Six1及侵襲相關(guān)CDH1(E-cadherin)蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.miR-204-5p下游靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果及對(duì)靶基因Six1調(diào)節(jié)作用的研究結(jié)果
　　(1)生物信息學(xué)分析:三種在線(xiàn)

12、數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan、miRDIP、miRBase預(yù)測(cè)并篩選出miR-204-5p的靶基因Six1;分析結(jié)果顯示，miR-204-5p與Six13'-UTR存在兩個(gè)7bp互補(bǔ)配對(duì)位點(diǎn)。
　　(2)雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證實(shí)了miR-204-5p可與Six13'-UTR結(jié)合。
　　(3)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到miR-204-5p下調(diào)Six1蛋白的表達(dá)水平。
　　(4)Western blot檢測(cè)到不含3'-UTR的外源

13、性Six1 CDs序列重組基因不受miR-204-5p的調(diào)控，并且miR-204-5p對(duì)Six1的抑制作用可通過(guò)引入外源性Six1而逆轉(zhuǎn)。
　　2.miR-204-5p及Six1在乳腺癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)
　　在miR-204-5p高表達(dá)的乳腺癌組織標(biāo)本當(dāng)中，Six1呈現(xiàn)出低表達(dá);而在miR-204-5p低表達(dá)的乳腺癌組織標(biāo)本當(dāng)中，Six1呈現(xiàn)出高表達(dá)。miR-204-5p及Six1在乳腺癌組織中的表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)。

14、
　　3.miR-204-5p通過(guò)靶向調(diào)控Six1抑制乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲，但并不影響其增值能力。
　　(1)miR-204-5p mimic成功轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞miR-204-5p的表達(dá)明顯升高。miRNC成功轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后陰性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組相比， MCF-7細(xì)胞中miR-204-5p的表達(dá)明顯降低。
　　(2)MTT法檢結(jié)果，MC

15、F-7-miR204組與陰性對(duì)照mimic NC相比，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染miR-204-5pmimic對(duì)細(xì)胞增殖的影響，24h T=0.636，P=0.543;48h T=0.842，P=0.424;72h T=1.716， P=0.125; P值均＞0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-204-5p表達(dá)水平改變可能對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖無(wú)影響，miR-205-5p并非乳腺癌細(xì)胞增殖相關(guān)基因。
　　(3)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)24

16、h無(wú)血清培養(yǎng)后，與miR-204-5p mimic組相比，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組的劃痕距離明顯減少，實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)明顯劃痕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-204-5p過(guò)表達(dá)可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞遷移。
　　(4)Matrigel-Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞miR-204-5p mimics轉(zhuǎn)染組的遷移能力明顯弱于mimics NC組，MDA-MB-231細(xì)胞miR-204-5p mimics轉(zhuǎn)染組的遷移能力也明顯弱于mimics NC

17、組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，T=15.469， P=0.000，結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　體外實(shí)驗(yàn)表明，外源性過(guò)表達(dá)miR-204-5p不能影響乳腺癌細(xì)胞的增值能力，但是外源性過(guò)表達(dá)miR-204-5p可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力，miR-204-5p可作為腫瘤抑制基因。
　　4.Six1/miR-204-5p形成負(fù)反饋調(diào)控環(huán)路
　　(1)Six1 siRNA組miR-204-5p表達(dá)量明顯高于NC組及

18、Six1過(guò)表達(dá)組，表明Six1可抑制miR-204-5p基因的表達(dá)。
　　(2)miR-204-5p過(guò)表達(dá)組相比較mimic NC組的Six1蛋白表達(dá)量明顯降低，內(nèi)源性miR-204-5p與Six1在乳腺癌中表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　可見(jiàn)，Six1在乳腺癌中可抑制miR-204-5p表達(dá)。并且miR-204-5p通過(guò)抑制Six1的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)CDH1的表達(dá)量，從而抑制乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲。因此，miR-20