1、目的:
　　腫瘤(tumor)是生物機體在各種生物、理化等各種致瘤因素的作用下，組織中的某單一細胞在遺傳學或表觀遺傳學水平上失去對其生長的正常調(diào)控，進而導致單細胞克隆性異常增生而產(chǎn)生的新生物。腫瘤常分為良性和惡性兩大類，通常所謂的“癌癥”是生物體內(nèi)所有的惡性腫瘤的統(tǒng)稱。
　　微小RNA(microRNA)是一類長度為19～25個核苷酸的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，在眾多生物學過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，例如胚胎發(fā)育、組織器官形成

2、、病毒防御、細胞增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展等。miRNA可以通過與靶基因mRNA3'-UTR的特定位點結(jié)合，遏制其翻譯過程或誘導其降解，從而參與基因的表達調(diào)控。miRNA可參與腫瘤相關(guān)的多種信號通路，與腫瘤的產(chǎn)生、增值、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)。目前，諸多文獻報道乳腺癌中多種miRNAs表達異常，例如miR-200、let-7和miR-10b。因此，進一步研究miRNA在乳腺癌中的表達水平及其功能有利于我們更好的理解乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，并

3、力求找到能有效防控腫瘤發(fā)生發(fā)展的新策略。
　　Six1首先在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，作為Six家族成員之一，發(fā)揮著類似于其家族成員所擁有的廣泛而又強大的作用。目前為止，Six1的研究對理解腫瘤發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義，同時為腫瘤診斷及治療提供潛在的的靶點。
　　本課題首先利用生物信息學技術(shù)，同時使用三種在線生物信息學軟件TargetScan，mirDIP及miRDB協(xié)同篩查，篩選出miR-204-5p潛在的下游靶基因，并綜合挑選評分數(shù)

4、較高的100個潛在靶點，剔除已有研究報道證實的靶點，進一步利用雙熒光素酶及免疫印跡實驗等技術(shù)對挑選的的靶基因進行驗證。并結(jié)合臨床標本，利用原位雜交技術(shù)檢測miR-204-5p在乳腺癌組織中的表達水平，同時通過免疫組化實驗技術(shù)檢測相應靶基因在相同乳腺癌組織中的表達水平。其次通過體外細胞功能實驗來研究miR-204-5p對乳腺癌細胞增值、遷移及侵襲等多種生物學行為的影響。由于Six1具有轉(zhuǎn)錄因子功能，本實驗進一步通過實時熒光定量PCR檢測其

5、可能對miR-204-5p及相關(guān)基因表達水平的影響，以期闡明其在乳腺癌中發(fā)揮作用的分子機制。本課題的研究成果將進一步加深我們對乳腺癌發(fā)生發(fā)展機制的了解，為乳腺癌的早期診斷及治療提供新的策略，或可以為此疾病的新藥研發(fā)提供關(guān)鍵的分子靶點。
　　方法：
　　1.miR-204-5p下游靶基因的預測及對靶基因Six1調(diào)節(jié)作用的研究
　　通過miRNA靶基因預測網(wǎng)站包括TargetScan、mirDIP、miRBase對miR-

6、204-5p可能的作用靶點進行預測。2.以MCF-7細胞總RNA為模板，擴增基因Six1 mRNA3'-UTR序列，連接psiCHECKTM-2載體，構(gòu)建psiCHECKTM--Six1-3-UTR野生型熒光素酶重組質(zhì)粒。3.以psiCHECKTM-2-Six1-3'-UTR重組質(zhì)粒為模板，進行亞克隆。采用SOE的方法，擴增Six1-3'-UTR突變型重組質(zhì)粒，包括psiCHECKTM-2-Six1-3'-UTR-Mut-1+Mut-2

7、、psiCHECKTM-2-Six1-3'-TR-Mut-1、psiCHECKTM-2-Six1-3'-UTR-Mut-2。4.采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對靶基因的確認。設計miR-204-5p mimic組、mimic NC組進行實驗，分別轉(zhuǎn)染293T、MCF-7、MDA-MB-231細胞，48h后收集各組熒光信號，實驗采用One-WayANOVA統(tǒng)計方法進行分析。
　　2.miR-204-5p及Six1在乳腺癌中的表達及意

8、義
　　收集30例乳腺癌新鮮臨床標本，分別采用原位雜交技術(shù)(in situ hybridization，ISH)和免疫組織化學技術(shù)（immunohistochemistry，IHC）檢測miR-204-5p和Six1在相同連續(xù)乳腺癌組織切片中的表達水平，并分析兩者表達關(guān)聯(lián)性及獨立臨床意義。
　　3.miR-204-5p對乳腺癌細胞生物學功能的影響
　　(1)實驗分為兩組:MCF-7-NC細胞組（陰性對照）、MCF-7-

9、miR-204細胞組（實驗組）。
　　(2)MTT實驗檢測并繪制0h、12h、24h及48h出各組細胞生長增殖曲線，評估m(xù)iR-204-5p對于MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖能力的影響。
　　(3)劃痕實驗檢測MCF-7各組細胞遷移能力，評估過表達miR-204-5p對MCF-7細胞遷移能力的影響。
　　(4)Matrigel-Transwell實驗檢測并獲取各組乳腺癌細胞侵襲實驗圖，評價miR-204

10、-5p對MCF-7、MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響。
　　4.Six1/miR-204-5p反饋調(diào)節(jié)分子機制的研究
　　(1)以MCF-7細胞總RNA為模板，擴增基因Six1 mRNA CDs序列并構(gòu)建pcDNA-3.1-Six1重組質(zhì)粒。
　　(2)分別用NC、Six1-siRNA1，Six1-siRNA2、pcDNA3.0-Six1轉(zhuǎn)染MCF-7細胞，采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后各組miR-204-

11、5p的表達量，并分析其意義。
　　(3)并且分別用mimics NC、miR-204-5p mimics、siRNA1、siRNA2、Six1+siRNA1、Six1+siRNA2轉(zhuǎn)染MCF-7細胞株，免疫印跡實驗檢測Six1及侵襲相關(guān)CDH1(E-cadherin)蛋白表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.miR-204-5p下游靶基因的預測結(jié)果及對靶基因Six1調(diào)節(jié)作用的研究結(jié)果
　　(1)生物信息學分析:三種在線

12、數(shù)據(jù)庫TargetScan、miRDIP、miRBase預測并篩選出miR-204-5p的靶基因Six1;分析結(jié)果顯示，miR-204-5p與Six13'-UTR存在兩個7bp互補配對位點。
　　(2)雙熒光素酶報告基因結(jié)果證實了miR-204-5p可與Six13'-UTR結(jié)合。
　　(3)免疫印跡實驗檢測到miR-204-5p下調(diào)Six1蛋白的表達水平。
　　(4)Western blot檢測到不含3'-UTR的外源

13、性Six1 CDs序列重組基因不受miR-204-5p的調(diào)控，并且miR-204-5p對Six1的抑制作用可通過引入外源性Six1而逆轉(zhuǎn)。
　　2.miR-204-5p及Six1在乳腺癌中的表達呈負相關(guān)
　　在miR-204-5p高表達的乳腺癌組織標本當中，Six1呈現(xiàn)出低表達;而在miR-204-5p低表達的乳腺癌組織標本當中，Six1呈現(xiàn)出高表達。miR-204-5p及Six1在乳腺癌組織中的表達水平呈現(xiàn)出明顯的負相關(guān)。

14、
　　3.miR-204-5p通過靶向調(diào)控Six1抑制乳腺癌細胞遷移及侵襲，但并不影響其增值能力。
　　(1)miR-204-5p mimic成功轉(zhuǎn)染MCF-7細胞后，實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測MCF-7細胞miR-204-5p的表達明顯升高。miRNC成功轉(zhuǎn)染至MCF-7細胞，轉(zhuǎn)染后陰性對照組與實驗組相比， MCF-7細胞中miR-204-5p的表達明顯降低。
　　(2)MTT法檢結(jié)果，MC

15、F-7-miR204組與陰性對照mimic NC相比，采用獨立樣本t檢驗分析轉(zhuǎn)染miR-204-5pmimic對細胞增殖的影響，24h T=0.636，P=0.543;48h T=0.842，P=0.424;72h T=1.716， P=0.125; P值均＞0.05。實驗結(jié)果表明miR-204-5p表達水平改變可能對MCF-7細胞的增殖無影響，miR-205-5p并非乳腺癌細胞增殖相關(guān)基因。
　　(3)劃痕實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過24

16、h無血清培養(yǎng)后，與miR-204-5p mimic組相比，轉(zhuǎn)染陰性對照組的劃痕距離明顯減少，實驗組可見明顯劃痕。實驗結(jié)果表明miR-204-5p過表達可促進MCF-7細胞遷移。
　　(4)Matrigel-Transwell實驗結(jié)果顯示，MCF-7細胞miR-204-5p mimics轉(zhuǎn)染組的遷移能力明顯弱于mimics NC組，MDA-MB-231細胞miR-204-5p mimics轉(zhuǎn)染組的遷移能力也明顯弱于mimics NC

17、組，實驗結(jié)果通過獨立樣本t檢驗，T=15.469， P=0.000，結(jié)果差異具有統(tǒng)計學意義。
　　體外實驗表明，外源性過表達miR-204-5p不能影響乳腺癌細胞的增值能力，但是外源性過表達miR-204-5p可明顯抑制乳腺癌細胞的遷移及侵襲能力，miR-204-5p可作為腫瘤抑制基因。
　　4.Six1/miR-204-5p形成負反饋調(diào)控環(huán)路
　　(1)Six1 siRNA組miR-204-5p表達量明顯高于NC組及

18、Six1過表達組，表明Six1可抑制miR-204-5p基因的表達。
　　(2)miR-204-5p過表達組相比較mimic NC組的Six1蛋白表達量明顯降低，內(nèi)源性miR-204-5p與Six1在乳腺癌中表達呈顯著負相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　可見，Six1在乳腺癌中可抑制miR-204-5p表達。并且miR-204-5p通過抑制Six1的表達，進而上調(diào)CDH1的表達量，從而抑制乳腺癌細胞遷移及侵襲。因此，miR-20